白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白在DENV2感染HaCaT细胞中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白促进登革病毒增殖的作用，其制备方法包括rAb‑34K2蛋白能促进DENV2在HaCaT细胞中增殖。其机制是抑制感染DENV2的HaCaT细胞表达Ⅰ型干扰素IFN‑α/β促进病毒增殖，同时rAb‑34K2蛋白能诱导感染DENV2的HaCaT细胞发生凋亡，对研究白纹伊蚊唾液蛋白组分在蚊虫传病机制中具有重要意义。

The use of Aedes albopictus salivary 34K2 recombinant protein in DENV2 infected HaCaT cells

The present invention relates to the field of biotechnology, in particular to a Aedes albopictus salivary 34K2 recombinant protein to promote dengue virus proliferation, its preparation method including rAb 34K2 protein can promote the proliferation of DENV2 in HaCaT cells. The mechanism of inhibiting DENV2 infection of HaCaT cells expressing IFN type I interferon alpha / beta promotes the proliferation of virus, and rAb 34K2 protein can induce the apoptosis of HaCaT cells infected with DENV2, has important significance in the research on the mechanism of disease transmission of mosquito Aedes albopictus salivary protein group.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白在DENV2感染HaCaT细胞中的应用。
技术介绍
蚊虫唾液蛋白具有抗凝血、抗炎、免疫调控的功能，是当前研究的热点。唾液腺转录组学和蛋白质组学研究均发现在伊蚊属蚊虫唾液腺中有一组雌蚊特异性高表达、分子量大小为34kDa但功能未知的唾液组分蛋白，故命名为34K蛋白家族。该蛋白编码基因均含有信号肽序列，表明其参与组成蚊虫唾液组分蛋白。白纹伊蚊俗称花脚蚊，因生性凶猛、攻击力强，也被称为“亚洲虎蚊”，是我国登革热的重要媒介。对白纹伊蚊唾液腺组学研究显示有两个34K蛋白存在于白纹伊蚊唾液内，分别命名为34K1，34K2。我们先前的研究发现蚊虫吸血可调控34K2蛋白的表达，但该蛋白在蚊虫吸血、传病中的作用并不清楚。为此，我们依据NCBI上白纹伊蚊34K-2成熟肽基因序列，原核克隆表达了该蛋白并分离纯化获得了有活性的重组蛋白，进而探讨了该重组蛋白在DENV2感染HaCaT细胞(人角质形成细胞)中的应用。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白(以下简称rAb-34K2)在DENV2感染HaCaT细胞中的应用。为达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白在DENV2感染HaCaT细胞中的应用，其包括以下内容：(1)包括白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白在DENV2感染HaCaT细胞中细胞增殖和抑制病毒增殖中的应用；a)上述应用是利用实时无标记细胞动态分析法监测不同浓度的白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白对HaCaT细胞生长的影响；b)对DENV2感染HaCaT细胞中抑制病毒增殖的应用，是通过DENV2NS1基因/内参基因GAPDHRNA的比值对病毒核酸相对表达量进行统计学分析；上述对病毒核酸相对表达量进行统计学分析，包括以下步骤：①以感染DENV2的HaCaT细胞的RNA逆转录的cDNA为模板，用引物NSIF(SEQIDNO：1)和NS1R(SEQIDNO：2)、引物GAPDHF(SEQIDNO：3)和GAPDHR(SEQIDNO：4)分别对NSI基因和GAPDH基因的进行PCR扩增；②扩增产物经纯化回收后进行10-3-10-9的梯度稀释用作模板；③用qRT-PCR检测不同浓度梯度下各基因的扩增参数，建立标准曲线；④根据标准曲线对不同浓度白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白对DENV2感染HaCaT细胞中病毒核酸进行动态检测并进行统计学分析；(2)白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白在DENV2感染HaCaT细胞中调控细胞表达因子的应用；上述应用是利用qRT-PCR实时检测不同浓度的白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白对DENV2感染HaCaT细胞中IFN-α/β、IL-1β、TNF-α、及IL-10的mRNA变化的影响；qRT-PCR的反应程序为95℃，8min；95℃，30s；60℃，30s；72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；(3)白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白在DENV2感染HaCaT细胞中促进细胞凋亡的应用；上述应用是是采用流式细胞术检测白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白对DENV2感染前后HaCaT细胞凋亡的影响。本专利技术的有益效果为：本实验将已获得rAb-34K2蛋白作用于人角质形成细胞，观察细胞内登革病毒的增殖作用。rAb-34K2蛋白能促进DENV2在HaCaT细胞中增殖，其机制是通过抑制感染DENV2的HaCaT细胞表达Ⅰ型干扰素IFN-α/β促进病毒增殖；同时rAb-34K2蛋白还能诱导感染DENV2的HaCaT细胞发生凋亡，促进病毒的扩散。研究结果对阐明白纹伊蚊唾液蛋白在病毒传播中的作用具有重要意义。附图说明图1、不同浓度的rAb-34K2蛋白作用HaCaT细胞生长的最大CI；图2、不同浓度的rAb-34K2蛋白作用HaCaT细胞生长的CIT50；图3、RT-PCR扩增DENV2感染HaCaT细胞NS1基因的表达，Maker:DL2000；1：DENV2感染HaCaT细胞；2：未感染病毒HaCaT细胞；3：空白对照；图4、不同浓度的rAb-34K2蛋白对DENV2(MOI＝1)感染HaCaT细胞最大CI值的影响；图5、不同浓度的rAb-34K2蛋白对DENV2(MOI＝1)感染HaCaT细胞CIT50的影响；图6、不同时间点不同浓度的rAb-34K2蛋白与DENV2(MOI＝1)作用HaCaT细胞后DENV2NS1RNA的相对表达量；图7、不同时间点不同浓度的rAb-34K2蛋白与DENV2(MOI＝0.1)作用HaCaT细胞后DENV2NS1RNA相对表达量；图8、不同时间点不同浓度的rAb-34K2蛋白与DENV2(MOI＝1)作用HaCaT细胞后IFN-αmRNA相对表达量(n＝4)；图9、不同时间点不同浓度的rAb-34K2蛋白与DENV2(MOI＝1)作用HaCaT细胞后IFN-βmRNA相对表达量(n＝4)；图10、不同浓度的rAb-34K2蛋白与DENV2(MOI＝1)作用HaCaT细胞后IL-1βmRNA相对表达量(n＝4)；图11、不同浓度的rAb-34K2蛋白与DENV2(MOI＝1)作用HaCaT细胞后TNF-αmRNA相对表达量(n＝4)；图12、不同浓度的rAb-34K2蛋白与DENV2(MOI＝1)作用HaCaT细胞后IL-10mRNA相对表达量(n＝4)；图13、不同浓度的rAb-34K2蛋白处理24h后对HaCaT细胞凋亡的影响(n＝3)；图14、不同浓度的rAb-34K2蛋白对DENV2(MOI＝1)感染的HaCaT细胞凋亡的影响(n＝3)。具体实施方式结合以下具体实施例和附图。对本专利技术进一步详细说明，本专利技术的保护内容不局限于以下实施例。应当指出的是，对本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施本专利技术的过程、条件、试剂、试验方法等，除以下专门提及的内容外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本专利技术没有特别限制内容。实施例1：rAb-34K2蛋白对HaCaT细胞增殖的分析为检测不同浓度rAb-34K2蛋白对HaCaT细胞的增殖是否有直接影响，本实验用Hepes缓冲液将rAb-34K2唾液蛋白稀释后分为：1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL各组，同时设置相应浓度梯度的BSA蛋白对照、阴性对照(Hepes缓冲液对照)及空白对照，以人角质形成细胞(HaCaT)数为2×104cells/100μL接种在E-Plate检测板中，运用RTCA动态监测细胞生长曲线的变化，检测不同浓度的rAb-34K2唾液蛋白对HaCaT细胞生长的影响。上述RTCA动态监测细胞生长曲线的方法如下：(1)在E-Plate16板中加入DMEM完全培养基于RTCAStations上检测基线；(2)在超净工作台内吸旧培养液，用PBS液清洗后向培养皿内加入1mL25％胰蛋白酶溶液，置于37°温箱中温育2-6min后，在倒置显微镜下观察细胞被消化的情况，若细胞质回缩，细胞间歇增大，终止消化。(3)吸除消化液并加入10mL培养基，反复轻轻吹打后1000rpm离心5min，去除上清，加入新鲜培养基，吹打均匀。用计数板计数细胞悬液浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白的应用，其特征在于：白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白在DENV2感染HaCaT细胞中的应用。

【技术特征摘要】
1.一种白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白的应用，其特征在于：白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白在DENV2感染HaCaT细胞中的应用。2.根据权利要求1所述的的应用，其特征在于：所述的白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白在DENV2感染HaCaT细胞中细胞增殖和抑制病毒增殖中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：是利用实时无标记细胞动态分析法监测不同浓度的白纹伊蚊唾液34K2重组蛋白对HaCaT细胞生长的影响。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：对DENV2感染HaCaT细胞中抑制病毒增殖的应用，是通过DENV2NS1基因/内参基因GAPDHRNA的比值对病毒核酸相对表达量进行统计学分析。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述统计学分析，包括以下步骤：(1)以感染DENV2的HaCaT细胞的RNA逆转录的cDNA为模板，用引物NSIF(SEQIDNO：1)和NS1R(SEQIDNO：2)、引物GAPDHF(SEQIDNO：3)和GAPDHR(SEQIDNO：4)分别对NSI基因和GAPDH基因的进行PCR扩增；(2)扩增产物经纯化回收后进行10-3-10-9的梯度稀释用...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴家红，商正玲，程金芝，马亚萍，
申请(专利权)人：贵州医科大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52