获自埃及伊蚊的天蚕素及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种获自埃及伊蚊的天蚕素及其编码基因和应用。本发明专利技术提供的蛋白，为如下（a）或（b）或（c）：（a）由序列表的序列1自N端第20至62位氨基酸残基组成的蛋白质；（b）由序列表的序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（c）将（a）或（b）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗菌肽功能的由其衍生的蛋白质。本发明专利技术进一步证实，AaCECN蛋白可以有效降低登革热病毒的感染能力。本发明专利技术具有广阔应用前景。

【技术实现步骤摘要】
获自埃及伊蚊的天蚕素及其编码基因和应用
本专利技术涉及一种获自埃及伊蚊的天蚕素及其编码基因和应用。
技术介绍
天蚕素(cecropins)是最早发现的昆虫抗菌肽，1980年，由Boman等从天蚕蛹中分离得到。该类多肽抗生素一般含有37～39个氨基酸残基，不含半胱氨酸，其N端区域具有强碱性，可形成近乎完美的双亲螺旋结构，而在C端区域可形成疏水螺旋，两者之间有甘氨酸和脯氨酸形成的铰链区，多数多肽的C端被酰胺化，酰胺化对其抗菌活性具有重要作用。抗菌肽的作用机理分为两种，即膜结构破坏型机制和非膜结构破坏型机制。(一)膜结构破坏型机制。该机制被广泛认为是抗菌肽的主要作用机理，该机制认为带阳离子的抗菌肽具有膜结合活性，与负电性的脂多糖紧紧结合或者中和细胞壁上某一区域的电荷，导致细胞壁结构变形，抗菌肽可以穿过细胞壁，然后通过静电作用结合到细胞膜表面，随后抗菌肽疏水尾部插入细胞膜中的疏水区域，穿过细胞外膜，然后杀死细菌。(二)非膜结构破坏型机制。有些抗菌肽能够通过复杂的机制抑制靶细胞壁组分的合成，或是破坏细胞壁结构，从而杀死靶细胞，有些抗菌肽可以通过抑制细胞呼吸、抑制细胞外膜蛋白的合成杀死细菌。据统计，因蚊子叮咬死亡的人数比其它任何动物导致的死亡人数更多，这是由于蚊子能够传播疟疾、登革病毒等疾病。据世界健康组织统计，一只蚊子能够感染100多人，在非洲平均每45秒疟疾将导致一名儿童死亡。蚊子虽然能够传播病毒，但是其自身却不会发病，表明蚊子体内免疫系统限制了病毒或者其他病原微生物的生长。蚊子缺乏获得性免疫系统，只能依靠天然免疫系统消灭病原微生物，抗菌肽作为天然免疫系统的一部分可能扮演了重要的角色。目前，耐药现象是使用抗生素过程中遇到的难题，随着超级耐药菌的出现，寻找新型抗生素就成为了一个迫在眉睫的问题。抗菌肽由于活性高，抗菌谱广，来源多样，而且由于其通过电荷吸附作用于病原微生物的膜上这一特殊机制，使得靶菌株不容易发生突变，因而在医药工业上认为有广阔的应用前景。昆虫只有天然免疫系统的保护，抗菌肽的作用是其免疫功能的重要部分，因此从昆虫分离得到的抗菌肽可能具有更强的抗病原微生物作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种获自埃及伊蚊的天蚕素及其编码基因和应用。本专利技术提供了一种获自埃及伊蚊的天蚕素，将其命名为AaCECN蛋白，为如下(a)或(b)或(c)：(a)由序列表的序列1自N端第20至62位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)由序列表的序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c)将(a)或(b)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗菌肽功能的由其衍生的蛋白质。编码所述AaCECN蛋白的基因也属于本专利技术的保护范围。编码所述AaCECN蛋白的基因可为如下(1)或(2)或(3)或(4)所述的DNA分子：(1)序列表的序列2自5’末端第58至186位核苷酸所示的DNA分子；(2)序列表的序列2所示的DNA分子；(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码具有抗菌肽功能的蛋白的DNA分子；(4)与(1)或(2)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有抗菌肽功能的蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜一次。含有编码所述AaCECN蛋白的基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本专利技术的保护范围。具有所述AaCECN蛋白的融合蛋白(简称AaCECN融合蛋白)也属于本专利技术的保护范围。所述AaCECN融合蛋白可为如下(d)或(e)或(f)：(d)由序列表的序列6自N端第19至94位氨基酸残基组成的蛋白质；(e)由序列表的序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(f)将(d)或(e)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗菌肽功能的由其衍生的蛋白质。编码所述AaCECN融合蛋白的基因也属于本专利技术的保护范围。编码所述AaCECN融合蛋白的基因可为如下(5)或(6)或(7)或(8)所述的DNA分子：(5)序列表的序列7自5’末端第55至282位核苷酸所示的DNA分子；(6)序列表的序列7所示的DNA分子；(7)在严格条件下与(5)或(6)限定的DNA序列杂交且编码具有抗菌肽功能的蛋白的DNA分子；(8)与(5)或(6)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有抗菌肽功能的蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜一次。含有编码所述AaCECN融合蛋白的基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本专利技术的保护范围。本专利技术还保护一种抑制微生物增殖和/或复制和/或感染的产品，包括所述AaCECN蛋白或所述AaCECN融合蛋白。所述微生物可为病毒，具体可为登革病毒，更具体可为登革2型病毒，如NewGuineaC株。本专利技术还保护所述AaCECN蛋白或所述AaCECN融合蛋白在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为抑制微生物增殖和/或复制和/或感染。所述微生物可为病毒，具体可为登革病毒，更具体可为登革2型病毒，如NewGuineaC株。本专利技术还保护所述AaCECN蛋白或所述AaCECN融合蛋白的应用；所述应用为抑制微生物增殖和/或复制和/或感染。所述微生物可为病毒，具体可为登革病毒，更具体可为登革2型病毒，如NewGuineaC株。本专利技术在埃及伊蚊中鉴定出了新的天蚕素，实验结果显示该天蚕素可以有效降低病原体增殖的能力。天蚕素是一类高度保守的携带正电荷的极性多肽，属于抗菌肽家族，可非特异性的结合到病原体表面并破坏病原体的外膜结构，从而起到杀灭病原体的作用。本专利技术发现，AaCECN基因被登革病毒感染诱导表达，在埃及伊蚊体内沉默AaCECN基因可以显著降低埃及伊蚊免疫系统对登革病毒感染的阻抑作用，AaCECN蛋白可以有效降低登革病毒的感染能力。本专利技术具有广阔应用前景。附图说明图1为实施例1的结果。图2为实施例2的结果。图3为实施例3中的Westernblot图谱。图4为实施例3中，Vero细胞中登革2型病毒的病毒量。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。埃及伊蚊(Aedesaegypti)：参考文献：ColpittsTM,CoxJ,VanlandinghamDL,FeitosaFM,ChengG,etal.(2011)AlterationsintheAedesaegyptiTranscriptomeduringInfectionwithWestNile,DengueandYellowFeverViruses.PLoSPathog7(9):e1002189.doi:10.1371/journal.ppat.1002189.。实施例中所用的登革2型病毒(denguevirustype-2，DENV-2)均为登革2型病毒NewGuineaC株；参考文献：Ch本文档来自技高网...

【技术保护点】
AaCECN蛋白或具有所述AaCECN蛋白的融合蛋白；所述AaCECN蛋白为如下（a）或（b）或（c）：（a）由序列表的序列1自N端第20至62位氨基酸残基组成的蛋白质；（b）由序列表的序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（c）将（a）或（b）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗菌肽功能的由其衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.AaCECN蛋白或具有所述AaCECN蛋白的融合蛋白在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为抑制微生物增殖和/或复制和/或感染；所述微生物为登革病毒；所述AaCECN蛋白为如下(a)或(b)：(a)由序列表的序列1自N端第20至62位氨基酸残基组成...

【专利技术属性】
技术研发人员：程功，肖小平，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11