获自埃及伊蚊的防御素及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种获自埃及伊蚊的防御素及其编码基因和应用。本发明专利技术提供的蛋白，为如下（a）或（b）或（c）或（d）或（e）：（a）由序列表的序列1自N端第24至99位氨基酸残基组成的蛋白质；（b）由序列表的序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（c）由序列表的序列4自N端第20至98位氨基酸残基组成的蛋白质；（d）由序列表的序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（e）将（a）或（b）或（c）或（d）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗菌肽功能的由其衍生的蛋白质。本发明专利技术进一步证实，AaDEF蛋白可以有效降低登革热病毒的感染能力。本发明专利技术具有广阔应用前景。

【技术实现步骤摘要】
获自埃及伊蚊的防御素及其编码基因和应用
本专利技术涉及一种获自埃及伊蚊的防御素及其编码基因和应用。
技术介绍
防御素(antimicrobialpeptide)是一类大自然界广泛存在的活性小肽，也称为宿主防御肽(hostdefensepeptide)。生物体在受到刺激时就会诱导产生防御素。防御素通常是由10-50多个氨基酸残基组成的碱性小分子多肽，含有4个或多于4个带正电荷的氨基酸(如赖氨酸或精氨酸)，N端亲水C端疏水，具有双亲的性质。防御素水溶性好，大部分防御素具有热稳定性(在100℃加热10-15min仍能保持其活性)。多数防御素的等电点大于7，表现出较强的阳离子特性，对较大的离子强度和较高或较低的pH值均具有较强的抗性，此外部分防御素具备抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力。防御素根据其来源分类，可以分成六大类：(1)昆虫防御素；(2)哺乳动物防御素；(3)两栖动物防御素；(4)鱼类、软体动物、甲壳类动物来源的防御素；(5)植物防御素；(6)细菌防御素。昆虫的免疫系统缺乏获得性免疫系统，只有天然免疫系统，防御素是其天然免疫系统的一个重要组成部分。昆虫防御素具有分子小，抗菌谱广，来源丰富，且仅作用于原核细胞及病变的真核细胞的特点，为替代抗生素提供了新的途径。除此之外，人们还发现，某些防御素对部分病毒、真菌、原虫和癌细胞等有杀灭作用，甚至能提高免疫力、加速伤口愈合过程，而且不破坏人体的正常细胞的特性。如能很好地开发利用，有望给临床医学、临床药学、食品加工、动物和植物转基因技术等领域带来革命性的进展，有着非常广阔的开发利用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种获自埃及伊蚊的防御素及其编码基因和应用。本专利技术提供了一种获自埃及伊蚊的防御素，将其命名为AaDEF蛋白，为如下(a)或(b)或(c)或(d)或(e)：(a)由序列表的序列1自N端第24至99位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)由序列表的序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c)由序列表的序列4自N端第20至98位氨基酸残基组成的蛋白质；(d)由序列表的序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(e)将(a)或(b)或(c)或(d)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗菌肽功能的由其衍生的蛋白质。编码所述AaDEF蛋白的基因也属于本专利技术的保护范围。编码所述AaDEF蛋白的基因可为如下(1)或(2)或(3)或(4)或(5)或(6)或(7)或(8)所述的DNA分子：(1)序列表的序列2自5’末端第70至297位核苷酸所示的DNA分子；(2)序列表的序列2所示的DNA分子；(3)序列表的序列3所示的DNA分子；(4)序列表的序列5自5’末端第58至294位核苷酸所示的DNA分子；(5)序列表的序列5所示的DNA分子；(6)序列表的序列6所示的DNA分子；(7)在严格条件下与(1)或(2)或(3)或(4)或(5)或(6)限定的DNA序列杂交且编码具有抗菌肽功能的蛋白的DNA分子；(8)与(1)或(2)或(3)或(4)或(5)或(6)或(5)或(6)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有抗菌肽功能的蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜一次。含有编码所述AaDEF蛋白的基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本专利技术的保护范围。具有所述AaDEF蛋白的融合蛋白(简称AaDEF融合蛋白)也属于本专利技术的保护范围。所述AaDEF融合蛋白可为如下(f)或(g)或(h)或(i)或(j)：(f)由序列表的序列9自N端第19至127位氨基酸残基组成的蛋白质；(g)由序列表的序列9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(h)由序列表的序列11自N端第19至130位氨基酸残基组成的蛋白质；(i)由序列表的序列11所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(j)将(f)或(g)或(h)或(i)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗菌肽功能的由其衍生的蛋白质。编码所述AaDEF融合蛋白的基因也属于本专利技术的保护范围。编码所述AaDEF融合蛋白的基因可为如下(9)或(10)或(11)或(12)或(13)或(14)所述的DNA分子：(9)序列表的序列10自5’末端第55至381位核苷酸所示的DNA分子；(10)序列表的序列10所示的DNA分子；(11)序列表的序列12自5’末端第55至390位核苷酸所示的DNA分子；(12)序列表的序列12所示的DNA分子；(13)在严格条件下与(9)或(10)或(11)或(12)限定的DNA序列杂交且编码具有抗菌肽功能的蛋白的DNA分子；(14)与(9)或(10)或(11)或(12)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有抗菌肽功能的蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜一次。含有编码所述AaDEF融合蛋白的基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本专利技术的保护范围。本专利技术还保护一种抑制微生物增殖和/或复制和/或感染的产品，包括所述AaDEF蛋白或所述AaDEF融合蛋白。所述微生物可为病毒，具体可为登革病毒，更具体可为登革2型病毒，如NewGuineaC株。本专利技术还保护所述AaDEF蛋白或所述AaDEF融合蛋白载制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为抑制微生物增殖和/或复制和/或感染。所述微生物可为病毒，具体可为登革病毒，更具体可为登革2型病毒，如NewGuineaC株。本专利技术还保护所述AaDEF蛋白或所述AaDEF融合蛋白的应用；所述应用为抑制微生物增殖和/或复制和/或感染。所述微生物可为病毒，具体可为登革病毒，更具体可为登革2型病毒，如NewGuineaC株。本专利技术在埃及伊蚊中鉴定两种新的防御素(AaDEFC蛋白和AaDEFD蛋白，因同源性很高，统称为AaDEF蛋白)，实验结果显示该两种防御素可以有效降低病原体增殖的能力。防御素是生物体内可诱导的一类小分子，一般含有29～34个氨基酸残基，其中6个保守的半胱氨酸形成3个分子内二硫键。防御素通过结合到病原微生物的膜上发挥作用，属于抗菌肽家族。本专利技术发现，AaDEFC蛋白和AaDEFD蛋白均被登革病毒感染诱导表达，在埃及伊蚊体内沉默AaDEFC基因或AaDEFD基因可以显著降低埃及伊蚊免疫系统对登革病毒感染的阻抑作用，AaDEFC蛋白和AaDEFD蛋白可以有效降低登革病毒的感染能力。本专利技术具有广阔应用前景。附图说明图1为实施例1的结果。图2为实施例2和实施例3的结果。图3为实施例4和实施例5中的Westernblot图谱。图4为实施例4和实施例5中，Vero细胞中登革2型病毒的病毒量。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。埃及伊蚊(Aedesaegypti)：参考文献：ColpittsTM,CoxJ,Vanla本文档来自技高网...

【技术保护点】
AaDEF蛋白或具有所述AaDEF蛋白的融合蛋白；所述AaDEF蛋白为如下（a）或（b）或（c）或（d）或（e）：（a）由序列表的序列1自N端第24至99位氨基酸残基组成的蛋白质；（b）由序列表的序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（c）由序列表的序列4自N端第20至98位氨基酸残基组成的蛋白质；（d）由序列表的序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（e）将（a）或（b）或（c）或（d）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗菌肽功能的由其衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.AaDEF蛋白或具有所述AaDEF蛋白的融合蛋白在制备试剂盒中的应用；所述应试剂盒的功能为抑制微生物增殖和/或复制和/或感染；所述微生物为登革病毒；所述AaDEF蛋白为如下(a)或(b)或(c)或(d)：(a)由序列表的序列1自N端第24至99位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)由序列表的序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c)由序列表的序列4自N端第20至98位氨基酸残基组成的蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：程功，肖小平，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11