抗菌肽HlDFS1及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种抗菌肽HlDFS1，抗菌肽HlDFS1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术还公开了上述抗菌肽HlDFS1在制备抗菌药物或抗病毒药物中的应用。本发明专利技术的抗菌肽HlDFS1，抗菌效果佳，其制备方法快速高效节能，能够获得其核酸，氨基酸序列信息，有利于大量生产。

Antimicrobial peptide HlDFS1 and its application

The invention relates to an antibacterial peptide HlDFS1, the amino acid sequence of antibacterial peptide HlDFS1 as shown in SEQ ID No.1. The invention also discloses the application of the antibacterial peptide HlDFS1 in the preparation of antibacterial drugs or antiviral drugs. The antibacterial peptide HlDFS1 has good antibacterial effect, and the preparation method is fast, efficient and energy-saving, and the nucleic acid and amino acid sequence information can be obtained, which is beneficial to mass production.

【技术实现步骤摘要】
抗菌肽HlDFS1及其应用
本专利技术涉及生物领域，尤其涉及一种抗菌肽HlDFS1及其应用。
技术介绍
目前，几乎所有的常规抗生素都出现了相应的抗药性致病株系，致病菌的抗药性问题已经日益严重地威胁着人们的健康。寻找全新类型的抗生素是解决抗药性问题的一条有效途径。抗菌肽，又称为宿主防御肽(素)，是由多种生物细胞特定基因编码的一类小分子裂解肽，通常只有几十到几百个氨基酸残基。在非特异性免疫系统中发挥重要作用，它可以抵抗不同种类的病原菌，如真菌、病毒，及一些细胞裂解酶等引起的感染。在人类研究中还具有抗肿瘤作用。抗菌肽多由唾液、体表黏液、循环系统和其它一些高位感染区分离得到。抗菌肽因为抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，可供选择的范围广，靶菌株不易产生抗性突变等原因，而被认为将会在医药工业上有着广阔的应用前景。蜱虫是仅次于蚊虫的第二大虫媒传染病传播媒介，已知蜱可携带至少83种病毒、14种细菌、17种回归热螺旋体、32种原虫，其中大多数是重要的自然疫源性疾病和人兽共患病，如森林脑炎、出血热、蜱传斑疹伤寒、野兔热等，给人类健康及畜牧业带来很大危害。蜱虫能携带多种致病微生物，并与这些致病微生物共存，其体内抗菌肽发挥了很大的保护作用。长角血蜱(Haemaphysalislongicornis)在我国大多数省份广泛分布，对其开展研究有利于对我国蜱虫传播疾病的治疗与控制。目前，国内涉及蜱虫抗菌肽的技术较少，申请号为201110025156.1的中国专利提供了一种来源长角血蜱的新型抗菌肽，并提供了其氨基酸序列，制备方法及用途。其制备方法通过收集长角血蜱的唾液，对唾液进行离心过滤层析纯化，得到抗菌肽组分再进行氨基酸序列分析。并对纯化后的抗菌肽进行了对革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌的抗菌实验。但该技术从蜱虫唾液中筛选纯化，对原材料蜱虫的要求量大，且纯化过程工序多，成本过高。该抗菌肽的制备过程中并未获得抗菌肽的核酸序列，不适合大量投入生产，以供后续开发使用。且该技术仅公开了抗菌肽对普通细菌的抗菌活性，并未涉及对其他微生物及抗生素耐药菌的抗菌活性的研究，说明其抗菌性能可能存在一定局限性。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种抗菌肽HlDFS1及其应用，本专利技术的抗菌肽HlDFS1，抗菌效果佳，对多种微生物具有抗菌性能，且其制备方法快速高效节能，能够获得其核酸，氨基酸序列信息，有利于大量生产。本专利技术公开了一种抗菌肽HlDFS1，抗菌肽HlDFS1的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。进一步地，编码抗菌肽HlDFS1的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。进一步地，抗菌肽HlDFS1的信号肽片段的基因序列如SEQIDNo.3所示。进一步地，抗菌肽HlDFS1的最小功能片段的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。抗菌肽HlDFS1的最小功能片段可通过多肽合成，大量获得具有生物学活性的抗菌肽HlDFS1，进而快速大量的投入实际应用。进一步地，抗菌肽HlDFS1来源于长角血蜱。也可从越原血蜱，嗜群血蜱，西藏血蜱，亚洲血蜱，中华血蜱，日本血蜱，森林革蜱，中华硬蜱等其他蜱类中发现同属抗菌肽家族的其他同源蛋白。进一步地，HlDFS1抗菌肽的制备方法包括以下步骤：(1)通过聚合酶链反应方法从长角血蜱cDNA文库中扩增出编码抗菌肽HlDFS1的目的基因；(2)将目的基因HlDFS1克隆到载体上，在大肠杆菌中表达，得到抗菌肽HlDFS1。进一步地，在步骤(1)中，载体为pGEX-6P-2、pET-28a、pET-32a或pET-41a。进一步地，在步骤(2)中，大肠杆菌为大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌DH10B或大肠杆菌Rosetta(DE3)。HlDFS1抗菌肽的制备也可以通过直接合成多肽的方法进行，从而获得有抗菌活性的抗菌肽HlDFS1。本专利技术还公开了上述抗菌肽HlDFS1在制备抗菌药物或抗病毒药物中的应用。进一步地，抗菌药物为抗细菌药物或抗真菌药物。进一步地，细菌为革兰氏阳性菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、牛型结核菌、革兰氏阴性菌和大肠杆菌中的一种或几种，真菌为白色念珠菌、皮肤藓菌、隐球菌、曲霉和克柔念珠菌中的一种或几种。进一步地，上述抗菌肽HlDFS1对部分临床耐药株，如：金黄色葡萄球菌527，鲍氏不动杆菌531亦有抗菌活性。借由上述方案，本专利技术至少具有以下优点：本专利技术提供了一种来源长角血蜱的新型抗菌肽，并在制备过程中，获得该抗菌肽的编码基因及氨基酸序列；该抗菌肽的制备方法高效节能，比直接从虫体中纯化要简单节约，并利于后期大量生产和应用；本专利技术的抗菌肽不仅对普通细菌具抗菌活性，还对两株耐药性细菌有抗菌活性，并通过细胞及动物实验验证了其作为药物的可能性和治疗效果。上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合附图详细说明如后。附图说明图1是本专利技术HlDFS1抗菌肽与其他抗菌肽序列差异的比较图；图2是本专利技术HlDFS1抗菌肽与抗菌肽同源性分析结果；图3图示了本专利技术HlDFS1抗菌肽的表达验证结果；图4图示了HlDFS1在未吸血(UF)和已吸血(FD)长角血蜱中表达差异；图5图示了HlDFS1最小功能片段对藤黄微球菌的抗菌活性；图6图示了HlDFS1最小功能片段对金黄色葡萄球菌的抗菌活性；图7图示了HlDFS1最小功能片段对大肠杆菌的抗菌活性；图8图示了HlDFS1最小功能片段对水泡型口炎病毒的抑制效果；图9为HlDFS1最小功能片段的溶血实验分析结果；图10为HlDFS1最小功能片段的细胞活性实验结果；图11图示了HlDFS1抗菌肽对感染藤黄微球菌的C3H小鼠治疗效果。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1抗菌肽HlDFS1的制备利用OMEGA公司的RNA提取试剂盒提取长角血蜱的总RNA(totalRNA)，并逆转录构建cDNA文库。取长角血蜱totalRNA进行高通量测序分析。对测序结果进行生物信息学分析，发现一种新的抗菌肽同源序列HlDFS1(长角血蜱抗菌肽1，Haemaphysalislongicornisdefensin1)，得出其对应的氨基酸序列，并分析了与其他已报道抗菌肽的序列差异(图1)及同源性(图2)。从分析结果可知，HlDFS1是一类新的新的抗菌肽。通过生物信息学分析，预测HlDFS1除信号肽外的序列(SEQIDNo.5)。设计克隆引物，前后克隆引物中都分别含有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。HlDFS克隆引物如下：HlDFS1-F：CGGGATCCAAAGGAGCAGTCACTGAAGAG(SEQIDNo.6)HlDFS1-R：GGAATTCACGGACGCAAGTGCAGGTGAG(SEQIDNo.7)通过PCR的方法从蜱虫cDNA文库中扩增出编码HlDFS1抗菌肽的目的基因，用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切。对载体pGEX-6P-2用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切。将酶切好的HlDFS1片段与pGEX-6P-2连接，转化到大肠杆菌DH5α，抽提质粒得到所需重组质粒pGEX-6P-2-HlDFS1。对重组质粒pGEX本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗菌肽HlDFS1，其特征在于：所述抗菌肽HlDFS1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种抗菌肽HlDFS1，其特征在于：所述抗菌肽HlDFS1的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。2.根据权利要求1所述的抗菌肽HlDFS1，其特征在于：编码所述抗菌肽HlDFS1的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。3.根据权利要求1所述的抗菌肽HlDFS1，其特征在于：所述抗菌肽HlDFS1的信号肽片段的基因序列如SEQIDNo.3所示。4.根据权利要求1所述的抗菌肽HlDFS1，其特征在于：所述抗菌肽HlDFS1的最小功能片段的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗菌肽，其特征在于，所述HlDFS1抗菌肽的制备方法包括以下步骤：(1)通过聚合酶链反应方法从长角血蜱cDNA文库中扩增出编码所述抗菌肽HlDFS1的目的基因；(2)将所述目的基因克隆到载体上，在大肠杆菌中表达，得到...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴建锋，潘文，孙塔，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32