细粒棘球绦虫TSP1重组蛋白及其可溶性表达方法和纯化方法技术

本发明专利技术提供细粒棘球绦虫TSP1重组蛋白，所述细粒棘球绦虫TSP1重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。本发明专利技术还提供了一种可溶性表达方法，实现了TSP1重组蛋白的高效可溶性表达：表达的重组蛋白质大部分为可溶性蛋白，占大肠杆菌可溶性总蛋白90%；然后用Ni‑NTA His‑Bind（Clontech）预装柱纯化重组细粒棘球绦虫TSP1，得到TSP1纯化蛋白。在使用洗脱缓冲液（500mM/L咪唑，20mM/L Tris，500mM/L NaCI，PH8.0）时可得到一种高纯度的细粒棘球绦虫TSP1。将该纯化蛋白作为包被抗原，可制备得到一种用于检测细粒棘球蚴病的ELISA试剂盒。

Echinococcus granulosus TSP1 recombinant protein and its soluble expression method and purification method

The invention provides a recombinant TSP1 protein, amino acid sequence of the recombinant TSP1 protein sequence table SEQ ID No.2. The invention also provides a method to realize the soluble expression, soluble expression of recombinant TSP1 protein: most of recombinant proteins are soluble protein, total soluble protein of Escherichia coli accounted for 90%; and then use the Ni NTA His Bind (Clontech) purification of recombinant Echinococcus granulosus TSP1 pre column. The purified protein TSP1. In the use of elution buffer (500mM/L imidazole, 20mM/L Tris 500mM/L, NaCI, PH8.0) can get a high purity of Echinococcus granulosus TSP1. The purified protein is used as a coated antigen, and a ELISA kit for detecting Echinococcus granulosus is prepared.

【技术实现步骤摘要】
细粒棘球绦虫TSP1重组蛋白及其可溶性表达方法和纯化方法
本专利技术属于基因工程
，具体涉及细粒棘球绦虫TSP1重组蛋白及其可溶性表达方法和纯化方法。
技术介绍
跨膜蛋白1（TSP1）是细粒棘球绦虫成虫cDNA文库中的一个抗原基因。TSP1是一种重要的细粒棘球绦虫抗原，可能参与了细粒棘球绦虫信号传导途径，对于细胞的生长、分化具有重要的生理意义。TSP1同膜联蛋白家族(Annexinfamily)成员可能是同源基因，属于Annexin家族。研究该抗原的生理功能，不仅可以了解其对于细粒棘球蚴的寄生、生长、发育等生命活动中的重要意义，还可以为治疗和预防包虫病提供新的药物靶点和候选疫苗。基于以上研究背景，本专利技术构建了编码细粒棘球绦虫TSP1基因的原核表达质粒，转化入大肠杆菌表达系统，诱导其可溶性表达，并进行蛋白纯化，得到了该蛋白，为其今后的免疫原性、生化特性分析以及功能研究奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术通过基因工程技术，提供了一种细粒棘球绦虫TSP1的原核表达载体pET30a-TSP1，利用该载体转化大肠杆菌（BL21-DE3）实现了TSP1的高水平可溶性表达。并提供了一种亲和层析纯化方法，纯化出了大量的高纯度的重组TSP1，用于TSP1免疫原性、生化特性分析以及功能研究，抗包虫疫苗、抗包虫药物的研发及囊型包虫病患者的免疫诊断。本专利技术提供细粒棘球绦虫TSP1重组蛋白，所述细粒棘球绦虫TSP1重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQIDNo.2。作为优选，所述细粒棘球绦虫TSP1重组蛋白编码的核苷酸序列为序列表SEQIDNo.1中第27位-836位碱基。本专利技术还提供上述细粒棘球绦虫TSP1重组蛋白的可溶性表达，步骤如下：（1）目的基因TSP1的扩增；（2）构建TSP1表达质粒：将步骤（1）制备的目的基因TSP1酶切并纯化后，构建入pET-30a相应的多克隆酶切位点，构建质粒pET30a-TSP1；（3）将步骤（2）制备的质粒pET30a-TSP1转化入E.ColiBL21(DE3)感受态细胞中，将E.ColiBL21(DE3)-pET30a-TSP1进行扩大培养，然后加入0.2mmol/L的IPTG于25℃，120r/min诱导振荡培养8小时；离心重悬后超声，收集上清液。作为优选，步骤（3）中所述扩大培养是将E.ColiBL21(DE3)-pET30a-TSP1先接种至LB固体培养基上，37℃孵育过夜；然后挑取培养基上单克隆至LB液体培养基中，于37℃，180r/min振荡培养3小时，使OD值至0.5；最后取菌液接种至LB液体培养基中，于37℃，180r/min振荡培养，使OD值至0.5。本专利技术还提供上述细粒棘球绦虫TSP1重组蛋白的纯化方法，是使用Ni-NTAHis-Bind（Clontech）纯化系统纯化重组蛋白，然后使用洗脱缓冲液进行洗脱；所述洗脱缓冲液的配方为：500mM/L咪唑，20mM/LTris，500mM/LNaCl，pH8.0。作为优选，步骤如下：（1）加入超纯水于Ni-NTAHis-Bind预装柱中，使其缓慢的流过柱内填充的介质；（2）加入结合缓冲液；所述结合缓冲液的配方为：20mM/LTris，500mM/LNaCl，20mM/L咪唑，pH8.0；（3）上样，加入超声破碎E.ColiBL21(DE3)-TSP1提取的上清液，静置后使上清液缓慢流过柱内介质；（4）加入结合缓冲液，使其缓慢流过柱内介质；所述结合缓冲液的配方为：20mM/LTris，500mM/LNaCl，20mM/L咪唑，pH8.0；（5）加入1号洗脱液，使其缓慢流过柱内介质，所述1号洗脱液的配方为：100mM/L咪唑，20mM/LTris，500mM/LNaCl，pH8.0；（6）加入2号洗脱液，使其缓慢流过柱内介质，所述2号洗脱液的配方为：200mM/L咪唑，20mM/LTris，500mM/LNaCl，pH8.0；（7）加入3号洗脱液，使其缓慢流过柱内介质，所述3号洗脱液的配方为：300mM/L咪唑，20mM/LTris，500mM/LNaCl，pH8.0；（8）加入4号洗脱液，使其缓慢流过柱内介质，所述4号洗脱液的配方为：400mM/L咪唑，20mM/LTris，500mM/LNaCl，pH8.0；（9）加入5号洗脱缓冲液，使其缓慢流过柱内介质，收集洗脱液；所述5号洗脱缓冲液的配方为：500mM/L咪唑，20mM/LTris，500mM/LNaCl，pH8.0。作为优选，所述超声破碎E.ColiBL21(DE3)-TSP1提取的上清液与洗脱缓冲液的体积比为1:1。本专利技术还提供上述细粒棘球绦虫TSP1重组蛋白在制备检测细粒棘球蚴病的ELISA试剂盒中的应用。本专利技术还提供一种检测细粒棘球蚴病的ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒中包被抗原为权利要求1或2所述的细粒棘球绦虫TSP1重组蛋白。作为优选，所述包被抗原用pH9.6的0.05M/L碳酸盐缓冲液稀释至终浓度8μg/ml；作为优选，所述试剂盒还包括封闭液，所述封闭液为含有5%脱脂奶粉的TBST，所述百分比的单位为g/ml。本专利技术提供了一种新的细粒棘球绦虫跨膜蛋白1（TSP1）基因及细粒棘球绦虫TSP1基因所编码的蛋白质，并提供了一种细粒棘球绦虫TSP1的原核表达载体pET30a-TSP1。该载体含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点和TSP1基因及一个组氨酸标签，从细粒棘球绦虫成虫cDNA文库中克隆出TSP1基因，用T7启动子控制它在大肠杆菌中的表达，利用该载体转化大肠杆菌(BL21-DE3)，并在较低温度、较低诱导剂浓度及较短诱导时间条件下诱导该菌，可实现TSP1的高效可溶性表达：表达的重组蛋白质大部分为可溶性蛋白，占大肠杆菌可溶性总蛋白90%。然后用Ni-NTAsuperflow亲和层析纯化重组细粒棘球绦虫TSP1，得到TSP1纯化蛋白。在使用洗脱缓冲液（500mM/L咪唑，20mM/LTris，500mM/LNaCI，PH8.0）10ml时可得到一种新的高纯度的细粒棘球绦虫TSP1。TSP1重组蛋白表达量高，且在特定的诱导条件下呈可溶性表达，纯化该蛋白的操作相当简单，成本也很低，极易重复使用。本专利技术所制备的重组蛋白可以用于囊型包虫病患者的免疫诊断，其作为免疫抗原能够被囊型包虫病患者血清识别，应用于间接ELISA检测时，具备较高的特异性和灵敏度，临床检测符合率高达90％。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为细粒棘球绦虫TSP1基因PCR扩增产物电泳结果；图2为细粒棘球绦虫TSP1的原核表达；图3为细粒棘球绦虫TSP1亲和层析纯化结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。实施例一细粒棘球绦虫TSP1基因序列及其编码的蛋白质序列细粒棘球绦虫TSP1全长1047个核苷酸，最大的开放阅读框（ORF）位于第27-836位，含810bp，起始密码子为atg，终止密码子为tga，编码269个氨基酸，其核苷酸序列及编码的氨基酸序列分本文档来自技高网...

【技术保护点】
细粒棘球绦虫TSP1重组蛋白，其特征在于：所述细粒棘球绦虫TSP1重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。

【技术特征摘要】
1.细粒棘球绦虫TSP1重组蛋白，其特征在于：所述细粒棘球绦虫TSP1重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQIDNo.2。2.根据权利要求1所述的细粒棘球绦虫TSP1重组蛋白，其特征在于：所述细粒棘球绦虫TSP1重组蛋白编码的核苷酸序列为序列表SEQIDNo.1中第27位-836位碱基。3.权利要求1或2所述的细粒棘球绦虫TSP1重组蛋白的可溶性表达，其特征在于：步骤如下：（1）目的基因TSP1的扩增；（2）构建TSP1表达质粒：将步骤（1）制备的目的基因TSP1酶切并纯化后，构建入pET-30a相应的多克隆酶切位点，构建质粒pET30a-TSP1；（3）将步骤（2）制备的质粒pET30a-TSP1转化入E.ColiBL21(DE3)感受态细胞中，将E.ColiBL21(DE3)-pET30a-TSP1进行扩大培养，然后加入0.2mmol/L的IPTG于25℃，诱导振荡培养8小时；离心重悬后超声，收集上清液。4.根据权利要求3所述的可溶性表达，其特征在于：步骤（3）中所述扩大培养是将E.ColiBL21(DE3)-pET30a-TSP1先接种至LB固体培养基上，37℃孵育过夜；然后挑取培养基上单克隆至LB液体培养基中，于37℃，180r/min振荡培养3小时，使OD值至0.5；最后取菌液接种至LB液体培养基中，于37℃，180r/min振荡培养，使OD值至0.5。5.权利要求1或2所述的细粒棘球绦虫TSP1重组蛋白的纯化方法，其特征在于：是使用Ni-NTAHis-Bind（Clontech）纯化系统纯化重组蛋白，然后使用洗脱缓冲液进行洗脱；所述洗脱缓冲液的配方为：500mM/L咪唑，20mM/LTris，500mM/LNaCl，pH8.0。6.根据权利要求5所述的纯化方法，其特征在于：步骤如下：（1）加入超纯水于Ni-NTAHis-Bind预装柱中，使其缓慢的流过柱内填充的介质；（2）加入结合缓冲液；所述结合缓冲液的配方为：20mM/LTri...

【专利技术属性】
技术研发人员：景涛，辛奇，孙旭东，袁苗苗，李焕平，高海军，宋晓霞，鲁俊，那斌，吕薇，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62