制备棘球康定Ｂ的方法技术

本发明专利技术公开一种制备棘球康定Ｂ的方法，该方法包括下列步骤：ａ）离心棘球康定Ｂ的发酵液，取菌丝体，用第一种溶剂浸取菌丝体中棘球康定Ｂ，过滤除去菌丝体；ｂ）将棘球康定Ｂ第一种溶剂浸取液中的溶剂蒸干，用第二种溶剂浸泡，过滤除去不溶物；ｃ）将棘球康定Ｂ第二种溶剂浸泡液蒸干后溶于第一种溶剂中，上大孔吸附树脂，用第一种溶剂进行洗脱，收集纯度较高的部分；ｄ）将棘球康定Ｂ收集液蒸干后溶于第二种溶剂中，上氧化铝柱，用第一种溶剂进行洗脱，收集洗脱液；ｅ）将棘球康定Ｂ洗脱液蒸干溶于第一种溶剂中，上反相树脂，用第一种溶剂进行洗脱，收集纯度较高的部分；ｆ）将棘球康定Ｂ收集液蒸干后用第一种溶剂溶解，滴加少量水使其过饱和后结晶析出，制得棘球康定Ｂ。本发明专利技术的制备棘球康定Ｂ的方法不仅能够很好的去除色素，且适合大规模的工业生产，具有很好的商业价值。该方法能将棘球康定Ｂ最终纯度提高到９５％以上。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于药物化学领域，具体涉及一种制备阿尼芬净的前体棘球康定B的方法。
技术介绍
自20世纪70年代以来，在临床治疗过程中，真菌感染疾病和由于无法 控制真菌感染而造成的死亡率逐渐提高，这与广泛使用对人体免疫系统有 损害的药物和大量使用广谱抗菌药物有直接的关系。另外，与临床使用体 内植入物和像艾滋病这样的慢性免疫抑制病毒的感染有关。因此，研究开 发安全、新型和有效的抗真菌药物显得非常重要。众所周知，真菌细胞是 具有细胞壁的，哺乳动物细胞没有细胞壁。因此，应将真菌的细胞壁作为 新型抗真菌药物的作用靶点。棘球康定类即是作用于真菌细胞壁的药物。棘球康定(Echinocandins)是20世纪70年代发现的一类天然产物，具 有非竞争性地抑制P-1， 3葡聚糖合成酶的活性。棘球康定这一名称最初指 的是一类具有相同的环状多肽核心和不同的脂肪酸侧链的环状脂肽类天 然抗真菌产物，现在棘球康定家族则包括棘球康定、cilofungin、 pneumocandins、 aculeucins、 mulundocandin以及W Fl 1899等成员。棘球康 定主要有三种类型B、 C以及D，其中棘球康定B是最主要的类型，它是 由A spergilusnid ulans和A.rugulosus产生的。阿尼芬静是棘球康定B的半 合成衍生物，目前正处在三期临床研究阶段。国内对于棘球康定B制备工艺的研究几乎没有报道，国外这些年对棘 球康定B的制备工艺也没有什么新的进展，目前所能知道的比较系统的研 究成果主要来自礼来公司的科研人员，但他们的工艺只能在实验室范围内 小规模的制备，难以实现工业化生产。美国专利4288549中详细介绍了礼来公司科研人员对棘球康定B的分 离提取工艺的研究，此工艺采用硅胶柱，萃取等方法纯化棘球康定B。它的主要缺点是过柱的压力过高，制备工艺难以放大；且对上游发酵液中的 色素不能很好的去除。
技术实现思路
为解决现有技术中尚无有效的分离提取棘球康定B的方法的技术问 题，本申请人专利技术了一种制备棘球康定B的简单方法，该方法不仅能够很 好的去除棘球康定B中的色素，且适合大规模的工业生产，具有很好的商 业价值。该方法能将棘球康定B最终纯度提高到95%以上。因此，本发朋提供一种制备棘球康定B的方法，该方法包括下列步骤a) 离心棘球康定B的发酵液，取菌丝体，用第一种溶剂浸取菌丝体中棘 球康定B，过滤除去菌丝体；b) 将棘球康定B第一种溶剂浸取液中的溶剂蒸干，用第二种溶剂浸泡， 过滤除去不溶物；c) 将棘球康定B第二种溶剂浸泡液蒸干后溶于第一种溶剂中，上大孔吸 附树脂，用第一种溶剂进行洗脱，收集洗脱液；d) 将棘球康定B收集液蒸干后溶于第二种溶剂中，上氧化铝柱，用第 一种溶剂进行洗脱，收集洗脱液；e) 将棘球康定B洗脱液蒸干溶于第一种溶剂中，上反相树脂，用第一种溶剂进行洗脱，收集洗脱液；f) 将棘球康定B收集液蒸干后用第一种溶剂溶解，滴加少量水使其过饱 和后结晶析出，制得棘球康定B。本专利技术方法中的第一种溶剂为甲醇或乙醇，优选甲醇；第二种溶剂为 正丁醇。本专利技术方法中用草酸将a)步骤中棘球康定B发酵液的pH值调为2 4，优 选pH值调为3。本专利技术方法a)步骤中甲醇所用的体积优选为菌丝体的1.5 2.5倍，优选 1,5倍。本专利技术方法a)步骤和b)步骤中的第一种溶剂的浓度优选大于90。/。。 本专利技术方法b)步骤中的第二种溶剂的浓度优选为100。/。。 本专利技术方法。步骤中的上柱时第一种溶剂的浓度为60%~70%，优选浓度为65%，洗脱时第一种溶剂浓度为85%~95%，优选浓度为90%。本专利技术方法(1)步骤中的上柱时第二种溶剂的浓度为80% 100%，优选浓度为100%，洗脱时第一种溶剂浓度为70%~80%，优选浓度为75%。本专利技术方法e)步骤中的上柱时第一种溶剂的浓度为60。/。 70。/。，优选浓度为65%，洗脱时第一种溶剂浓度为85%~95%，优选浓度为90%。本专利技术方法c)步骤中的洗脱液为纯度大于40M的部分；e)步骤中的洗脱液为纯度大于90%的部分。优选地，本专利技术方法d)步骤中的大孔吸附树脂为HP20树脂。 优选地，本专利技术方法e)步骤中的反相树脂为YPRII树脂。 本申请人通过对比例证明，由于棘球康定B溶液中的色素非常多，因此，通过c)步骤的吸附树脂，很多极性较大的色素吸附不上去，而棘球康定B能够很好的被吸附上去，用9: 1的第一种溶剂洗脱液洗脱时树脂上有很多色素不会被洗下来，因此该步的关键作用是去除色素。而d)步骤的主要作用是除去了很多极性较大的杂质，使得棘球康定B的纯度有较大的提高，上柱时棘球康定B能够很好的被吸附，选用4: 1的第一种溶剂洗脱时很多极性杂质不会被洗脱下来。同时，它也除去了吸附树脂不能完全除去的色素。本专利技术的e)步骤的主要作用是富集棘球康定B， 3: 1的第一种溶剂上柱棘球康定B能够被完全吸附，9: 1洗脱时棘球康定B被集中洗脱下来，液相检测发现，此树脂能够很好的去保留时间在棘球康定B峰附近的杂质。相对于现有技术，本专利技术的优点在于整个工艺流程简单，成本较低，不存在工厂放大问题，易于实现工业化生产。而且此工艺能够将发酵液中 的色素和杂质基本去除，使得目标产物的纯度达到理想的水平。具体实施例方式本专利技术棘球康定B HPLC检测条件如下色谱柱ODS-C18(5|I);检测波长222nm ;流动相水甲醇已腈(20: 70: 10);6流速0.800ml/min 柱温40°C本专利技术棘球康定B发酵条件如下菌种ATCC 58397 斜面培养 培养基PDA 条件25°C， 10天种子培养培养基葡萄糖1.0%、甘油1.0%、棉籽粉2.5%， pH为6.8-7.0 条件25°C， 2天，摇床转速250rpm发酵培养土昔养基葡萄糖2.0%、蔗糖2.0%、甘油2.0%、豆油2.0%、棉籽粉2.0%、 黄豆粉1.0%、酵母粉0.5%、 KH2PO40.5%、脯氨酸0.5%，消前pH7.0121。C灭菌20min，接种量10%，摇瓶装量100ml/750ml，置于25'C恒 温室中旋转式摇床250rpm摇瓶发酵9天后，得到棘球康定B发酵液。实施例l， 2， 3考察不同pH的发酵液对分离工艺的影响 实施例1:取棘球康定B发酵液500ml，其纯度为3.1%，单位为647ug/ml，将 发酵液pH调为2.0后静置一段时间，高速离心后弃去上清液，将菌丝体 用1.5倍的甲醇浸泡提取其中的棘球康定B，过滤除去菌丝体，再将甲醇 蒸干后用同样体积的正丁醇浸取棘球康定B，同样过滤除去其中的不溶物， 检测其纯度为8.0%。装一根高约20cm，直径约为4cm的HP20树脂柱，将棘球康定B蒸 干后溶解于3: l的甲醇水中，以10ml/min的流速过柱，棘球康定B完全 被吸附在柱上，再用9: 1的甲醇水洗脱柱子，分布收集洗脱液中纯度较 高的部分，检测发现纯度为34.7%，含有较为明显的色素，溶液呈淡红色。装一根高约为15cm，直径3cm的氧化铝柱。将棘球康定B收集液蒸干后用正丁醇溶解上柱，上柱流速控制在12ml/min，废液中没有棘球康定， 再用4: l的甲醇水洗脱柱子，收集所有流出液，此时棘球康定B纯度为 67.1%，大部分色素被除去，溶液本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备棘球康定Ｂ的方法，该方法包括下列步骤：　　　　ａ）离心棘球康定Ｂ的发酵液，取菌丝体，用第一种溶剂浸取菌丝体中棘球康定Ｂ，过滤除去菌丝体；　　　　ｂ）将棘球康定Ｂ第一种溶剂浸取液中的溶剂蒸干，用第二种溶剂浸泡，过滤除去不溶物；　　　　ｃ）将棘球康定Ｂ第二种溶剂浸泡液蒸干后溶于第一种溶剂中，上大孔吸附树脂，用第一种溶剂进行洗脱，收集洗脱液；　　　　ｄ）将棘球康定Ｂ收集液蒸干后溶于第二种溶剂中，上氧化铝柱，用第一种溶剂进行洗脱，收集洗脱液；　　　　ｅ）将棘球康定Ｂ洗脱液蒸干溶于第一种溶剂中，上反相树脂，用第一种溶剂进行洗脱，收集洗脱液；　　　　ｆ）将棘球康定Ｂ收集液蒸干后用第一种溶剂溶解，滴加少量水使其过饱和后结晶析出，制得棘球康定Ｂ。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：李继安，卢亮，颜晨晨，林惠敏，
申请(专利权)人：上海医药工业研究院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]