外泌体p-ERK在制备结直肠癌诊断产品中的应用制造技术

本发明专利技术公开了外泌体中p‑ERK在诊断结直肠癌中的应用。本发明专利技术的研究结果表明，正常非癌细胞的培养液中的外泌体中不含p‑ERK，结直肠癌细胞的培养液中的外泌体中含有较多p‑ERK，因此可将外泌体中p‑ERK作为诊断结直肠癌的分子标志物。本发明专利技术的研究成果为临床提供了一种具有广泛应用前景的结直肠癌无创诊断方法。

【技术实现步骤摘要】
外泌体p-ERK在制备结直肠癌诊断产品中的应用
本专利技术属于生物医学领域，涉及癌症的诊断，具体涉及外泌体p-ERK在诊断结直肠癌中的应用。
技术介绍
肿瘤组织活检常作为肿瘤诊断的金标准，但是组织活检技术有一定的局限性。主要表现为：肿瘤具有异质性；某些患者不适合做组织活检；组织活检的滞后性对患者的治疗不利。因此对于癌症的诊断和检测技术有更高的要求。液体活检技术的出现，解决了上述问题，也缩短了癌症的诊断时间。作为体外诊断的一个分支，液体活检就是通过检测血液或者尿液等体液中的某些生物活性分子，从而对癌症等疾病做出诊断。其优势在于能通过非侵入性取样降低活检的危害；由于其具有敏感性高、检测快捷等特点，而有利于肿瘤的早期发现。液体活检主要包括三种检测方法：游离DNA的检测、循环肿瘤细胞的检测、细胞外泌体的检测。外泌体是细胞内的多囊泡体与细胞质膜融合后主动分泌到细胞外的大小均一，直径为30-100nm的脂质双分子层结构囊泡。外泌体可由不同类型细胞(其中包括肿瘤细胞)脱落释放，在大多数体液如外周血、尿液、唾液、腹水、羊水、乳汁、脑脊液、关节液、支气管肺泡灌洗液等体液中可检测到。外泌体中含有许多生物活性物质，如蛋白质、mRNA，microRNA，DNA片段等，这些生物活性物质可在细胞间相互传递，进而调节细胞的生理功能。肿瘤细胞来源的外泌体可以通过多种途径调控肿瘤环境，进而促进肿瘤的进展。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可用于结直肠癌早期诊断的分子标志物。本专利技术研究发现，结直肠癌细胞培养液中外泌体内含有p-ERK，而正常的非癌细胞的细胞培养液中的外泌体中不含有p-ERK。根据以上研究成果，申请人发现了一种可用于结直肠癌无创诊断的方法，通过检测体液优选血液中外泌体p-ERK的有无或者表达量即可用于诊断结直肠癌。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了检测外泌体中p-ERK的试剂在制备结直肠癌诊断产品中的应用。进一步，所述检测外泌体中p-ERK的试剂包括任何可用于检测外泌体中p-ERK存在与否或检测p-ERK表达量的方法中使用的试剂。所述检测p-ERK存在与否或检测p-ERK表达量的方法选自以下组：免疫组织化学测定法、酶联免疫吸附测定法、原位杂交、色谱法、液相色谱法、尺寸排阻色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法、质谱法、串联质谱法、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法、电喷雾电离质谱法、表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱法、四极飞行时间质谱法、大气压光电离质谱法、傅里叶变换质谱法、基质辅助激光解吸/电离-傅里叶变换离子回旋共振质谱法、二次离子质谱法、放射性免疫测定法、显微镜检查、基于微流体芯片的测定法、表面等离子体共振、测序、蛋白质印迹测定法。进一步，检测外泌体中p-ERK的试剂包括p-ERK的抗体。所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、或免疫血清。根据本专利技术的另一个方面，本专利技术还提供了外泌体中p-ERK作为标志物在开发和/或设计结直肠癌诊断产品中的应用。根据本专利技术的再一个方面，本专利技术还提供了一种结直肠癌的诊断产品。所述诊断产品包括检测外泌体中p-ERK的试剂。进一步，所述检测外泌体中p-ERK的试剂包括任何可用于检测外泌体中p-ERK存在与否或检测p-ERK表达量的方法中使用的试剂。所述检测p-ERK存在与否或检测p-ERK表达量的方法选自以下组：免疫组织化学测定法、酶联免疫吸附测定法、原位杂交、色谱法、液相色谱法、尺寸排阻色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法、质谱法、串联质谱法、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法、电喷雾电离质谱法、表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱法、四极飞行时间质谱法、大气压光电离质谱法、傅里叶变换质谱法、基质辅助激光解吸/电离-傅里叶变换离子回旋共振质谱法、二次离子质谱法、放射性免疫测定法、显微镜检查、基于微流体芯片的测定法、表面等离子体共振、测序、蛋白质印迹测定法。进一步，检测外泌体中p-ERK的试剂包括p-ERK的抗体。所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、或免疫血清。进一步，所述试剂还可包括分离外泌体所用的试剂、裂解外泌体所用的试剂。所述分离外泌体所用的试剂包括任何能够分离外泌体的方法中使用的试剂。分离外泌体的方法包括但不限于超速离心法、沉淀法、分子排阻层析、表面蛋白标记亲和分离方法、免疫磁珠液相色谱法、超滤、试剂盒法。进一步，本专利技术的诊断产品可以是用于诊断的所有类型的产品，包括试剂、试剂盒、芯片、试纸。本专利技术用于诊断结直肠癌的外泌体来自体液，所述体液包括血液、尿液、唾液、腹水、羊水、乳汁、脑脊液、关节液、支气管肺泡灌洗液。优选地，本专利技术的用于诊断结直肠癌的外泌体来自血液。本专利技术的诊断产品进行结直肠癌诊断的步骤包括：(1)从体液中分离外泌体；(2)检测外泌体中p-ERK表达水平；(3)根据p-ERK表达信息帮助结直肠癌诊断。上述步骤中，所述体液包括血液、尿液、唾液、腹水、羊水、乳汁、脑脊液、关节液、支气管肺泡灌洗液。优选地，体液是血液。根据外泌体的大小、密度和表面标志物等物理化学性质，目前分离体液和细胞培养液中外泌体的方法有经典的超速离心法、沉淀法、分子排阻层析、表面蛋白标记亲和分离方法、免疫磁珠液相色谱法、超滤、试剂盒法。本专利技术的优点和有益效果如下：(1)血液中外泌体中蛋白是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发有助于结直肠癌的辅助诊断，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。(2)本专利技术开发了一种无创的用于诊断结直肠癌的方法，该方法操作方便、大大减轻了患者的痛苦。附图说明图1显示利用Westernblot检测外泌体中p-ERK含量的电泳图；图2显示利用电镜观察外泌体的形态图；图3显示利用Westernblot检测外泌体特征性标志物的电泳图。具体实施方式下面结合具体的实施例进一步说明本专利技术，本专利技术的实施例仅用于解释本专利技术，并不意味着限制本专利技术的保护范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1细胞培养液中外泌体的分离与鉴定1、细胞培养HT-29细胞及HUVECs细胞均于含10％胎牛血清和双抗(青霉素100U/ml、链霉素100U/ml)的DMEM培养基中，在37℃、5％CO2的条件下培养，细胞呈单层贴壁生长，常规换液、传代，选择对数生长期的细胞进行实验。2、细胞培养液中外泌体的分离采用ExoQuick-TCExosomePrecipitationSolution试剂盒，收集HT-29细胞培养液及HUVECs细胞培养液各10ml，3000×g，离心15min(4℃)，去除细胞和细胞碎片，上清转移到无菌容器中，加入2mlExoQuick-TCExosomePrecipitationSolution，颠倒和晃动试管使溶液混匀，4℃冷藏过夜(至少孵育12h)，试管在孵育过程中不要旋转，次日，将ExoQuick-TCExosomePrecipitationSolution/细胞培养液混合物以1500×g，离心30min(室温或4℃均可)，离心后，在试管底部的米色或白色沉淀即为外泌体，再次除上清，将试管1500×g本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测外泌体中p‑ERK的试剂在制备结直肠癌诊断产品中的应用。

【技术特征摘要】
1.检测外泌体中p-ERK的试剂在制备结直肠癌诊断产品中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括检测p-ERK存在与否或检测p-ERK表达量的方法中使用的试剂。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测p-ERK存在与否或检测p-ERK表达量的方法选自以下组：免疫组织化学测定法、酶联免疫吸附测定法、原位杂交、色谱法、液相色谱法、尺寸排阻色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法、质谱法、串联质谱法、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法、电喷雾电离质谱法、表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱法、四极飞行时间质谱法、大气压光电离质谱法、傅里叶变换质谱法、基质辅助激光解吸/电离-傅里叶变换离子回旋共振质谱法、二次离子质谱法、放射性免疫测定法、显微镜检查、基于微流体芯片的测定法、表面等离子体共振、测序、...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹邦伟，赵磊，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京友谊医院，
类型：发明
国别省市：北京,11