一种PWS及AS的快速检测方法技术

本发明专利技术涉及一种PWS及AS的快速检测方法，采用MS‑PCR方法检测PWS/AS，用重亚硫酸盐处理DNA样本，可以在短时间内完成，同时还采用柱上去亚硫酸基团的方法，使得整个操作流程更为简便，同时对多处细节做了处理和调整，形成了一套完整的检测体系，设置多个质控点，是通过临床验证可靠的检测方法。MS‑PCR是一种快速、高效，并且特异性和敏感性均佳的分子诊断方法，同时，检测成本较低，可诊断绝大多数的PWS/AS临床病例。

A rapid detection method of PWS and AS

The invention relates to a method for rapid detection of PWS and AS, using MS PCR PWS/AS detection method, using bisulfite treatment of DNA samples can be completed in a short period of time, while also using the method of post sulfite group, which makes the whole operation process is more simple, at the same time, many details do processing and adjustment and form a complete set of testing system, set up a number of control points, through clinical verification of reliable detection method. MS PCR is a fast, efficient, and at the same time, sensitivity and specificity are good molecular diagnostic methods, detection, low cost, can cut off most of the clinical diagnosis of PWS/AS.

【技术实现步骤摘要】
一种PWS及AS的快速检测方法
本专利技术属于遗传病基因检测
，涉及一种PWS及AS的快速检测方法。
技术介绍
PWS/AS是两种与基因组印记相关的遗传性疾病，父源15q11-13区域基因缺陷导致Prader-Willi综合征(PWS)，其临床表现为新生儿肌张力低，发育延迟，身材矮小，下丘脑性腺发育不良等；母源15q11-13区域基因缺陷导致Angelman综合症(AS)。15q11-13区带内各复制子之间发生非平衡易位，由于这些复制子中存在对物种生存相当重要的高度保守序列，因此，15q11-13遗传物质缺失将造成发育迟缓，语言障碍等临床表现。印记基因具有差异表达特性，这种差异常常是由父方及母方的等位基因传给子代时发生了修饰，其中较为重要的是DNA甲基化修饰。DNA甲基化修饰是一个主要的表观遗传学修饰。诊断PWS/AS疾病的方法有几种，如高分辨率染色体分析、荧光原位杂交、多重连接探针扩增技术(MLPA)。但是上述几种方法均比较复杂，需要时间较长，检测过程缓慢，成本高，检测结果存在不确定性。文献报道方法没有临床检测需要的质控，操作标准及其他环境控制指标。李璃、刘安等人发表了Prader-Willi和Angelman综合征的分子遗传学诊断研究，用全基因组单核苷酸多态性微阵列芯片(SNP-array)对疑似Prader-Willi综合征(PWS)和Angelman综合征(AS)患儿进行细胞分子遗传学诊断,并根据检测结果对其家系下一胎进行产前遗传学诊断。方法对3位疑似PWS和AS患儿进行常规G显带染色体核型分析；提取患者外周血DNA进行SNP-array扫描,阳性结果进行父母样本的SNP-array检测用以溯源。上述检测方法比较复杂，需要时间较长，检测过程缓慢。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术提供一种PWS及AS的快速检测方法，采用MS-PCR方法检测PWS/AS，用重亚硫酸盐处理DNA样本，可以在短时间内完成，同时还采用柱上去亚硫酸基团的方法，使得整个操作流程更为简便，同时对多处细节做了处理和调整，形成了一套完整的检测体系，设置多个质控点，是通过临床验证可靠的检测方法。MS-PCR是一种快速、高效，并且特异性和敏感性均佳的分子诊断方法，同时，检测成本较低，可诊断绝大多数的PWS/AS临床病例。本专利技术提供了如下的技术方案：一种PWS及AS的快速检测方法，包括以下步骤：(1).采集血液、羊水或唾液中的至少一种并进行DNA提取；(2).提取完DNA后，对其进行质量检测；(3).DNA甲基化处理，检测DNA甲基化处理后的浓度及纯度；(4).进行MS-PCR反应；(5).电泳检测，结果分析。优选的是，所述步骤(1)中采集全血采用EDTA抗凝管采集或采血卡采集。上述任一方案优选的是，所述用EDTA抗凝管采集具体操作方法为：采集待检者外周血5mL，立即轻柔颠倒混合采血管多次，混匀后4℃放置。将EDTA抗凝管分别包装，低温运输。上述任一方案优选的是，所述采血卡采集的具体操作方法为：采集完血液后，滴加在采血卡上，待其晾干后进行运送。上述任一方案优选的是，所述羊水采集的具体方法为：医生按标准采集后，专用包装保存，低温运输。上述任一方案优选的是，所述唾液采集的具体方法为：待检者按唾液试子采集要求采集唾液样本，低温运输。上述任一方案优选的是，所述步骤(1)中DNA提取常用例包括血斑DNA提取、全血DNA提取、羊水DNA提取、唾液DNA提取中的至少一种。上述任一方案优选的是，所述血斑DNA提取，采用QIAGEN试剂盒进行，使用试剂盒前需要先在缓冲液AW1和缓冲液AW2中加入无水乙醇。上述任一方案优选的是，所述全血DNA提取，采用任意提取方法或提取试剂盒提取，要求是DNA质量及浓度达到实验需求。上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中提取DNA后，使用nanodrop对所有DNA样本进行浓度、质量检测，达到既定质检标准，可进入下一步试验，质检不通过，需重新提取或纯化处理，直到质检通过。上述任一方案优选的是，所述步骤(3)中DNA甲基化处理方法包括以下步骤：(1).将待处理的DNA样本从-20℃取出，解冻，待DNA完全解冻后，轻微震荡离心；(2).取PCR管，加入待处理的DNA样本与CTConversionReagent，颠倒混匀，短暂离心；(3).将PCR管置于PCR仪上，条件如下：(4).将收集柱置于离心管中，加入M-BindingBuffer到收集柱中；(5).转移步骤2中的样本到收集柱中，盖紧管盖后颠倒混匀几次，离心，弃废液；(6).加M-Wash-Buffer到收集柱中，离心；(7).加M-DesulphonationBuffer到收集柱中，孵育，离心；(8).加M-WashBuffer到收集柱中，离心，重复操作；(9).转移收集柱到离心管中，加M-ElutionBuffer到收集柱，静置，离心，回收样本。上述任一方案优选的是，所述步骤(4)中MS-PCR引物为：反应体系为：MS-PCR反应程序为：上述任一方案优选的是，所述步骤(5)中电泳检测时采用采用3％琼脂糖凝胶电泳检测，50bpmarker或者100bpmarker标记。上述任一方案优选的是，所述步骤(5)中结果分析按照标准的依据，对检测结果进行判读。本专利技术的原理：正常人同时存在父源母源基因，而在患者中只存在父源或母源其中一方基因。位于15q11-13区域的小核糖核酸多肽N基因(SNRPN)序列经亚硫酸氢钠处理后，父源DNA非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而母源DNA甲基化胞嘧啶则不变，用特异PCR引物(父源P引物，母源M引物)，便可将等位基因区别开。有益效果(1).本专利技术用重亚硫酸盐处理DNA样本，可以在短时间内完成，同时还采用柱上去亚硫酸基团的方法，使得整个操作流程更为简便；(2).检测试剂统一处理保存，全部为一次性取用，不涉及反复冻融及交叉污染的问题，同时便于批量化操作，可以承接大检测样本通量；(3).形成完整的检测及质控体系，便于样本管控及问题查找；(4).优化后的最适实验条件，能有效保证检测的成功率，避免处理不当，目标区域扩增效率不高，必须进行重复检测带来的时间的不确定性；(5).检测流程标准化，有配套的操作规范和试验记录表单(按医学检测标准编写)，适用于PCR实验室的临床检测。附图说明图1为PWS家系检测MS-PCR电泳检测结果；注：M：Maker；1：阴性水对照；2：正常对照样本；3：病人样本；4：正常对照样本；图2为AS家系检测MS-PCR电泳检测结果；注：正常人有父源、母源两个扩增结果；母源缺失为AS患者，父源缺失为PWS患者。具体实施方式为了进一步了解本专利技术的技术特征，下面结合具体实施例对本专利技术进行详细地阐述。实施例只对本专利技术具有示例性的作用，而不具有任何限制性的作用，本领域的技术人员在本专利技术的基础上做出的任何非实质性的修改，都应属于本专利技术的保护范围。实施例一一种PWS及AS的快速检测方法按照以下步骤进行：1.样本采集及运输要求(医院采样)从基因水平来检测PWS-AS疾病，需要获得DNA样本，我们通过采集血液、羊水、唾液、组织进行基因组的提取。1.1EDTA抗凝管采集用EDTA抗凝管采集孕妇外周血5mL，立即轻柔颠倒混合采血管1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种PWS及AS的快速检测方法，其特征在于：包括以下步骤：(1).采集血液、羊水或唾液中的至少一种并进行DNA提取；(2).提取完DNA后，对其进行质量检测；(3).DNA甲基化处理，检测DNA甲基化处理后的浓度及纯度；(4).进行MS‑PCR反应；(5).电泳检测，结果分析。

【技术特征摘要】
1.一种PWS及AS的快速检测方法，其特征在于：包括以下步骤：(1).采集血液、羊水或唾液中的至少一种并进行DNA提取；(2).提取完DNA后，对其进行质量检测；(3).DNA甲基化处理，检测DNA甲基化处理后的浓度及纯度；(4).进行MS-PCR反应；(5).电泳检测，结果分析。2.根据权利要求1所述的PWS及AS的快速检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中采集血液采用EDTA抗凝管采集或采血卡采集。3.根据权利要求2所述的PWS及AS的快速检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中用EDTA抗凝管采集具体操作方法为：采集孕妇外周血5mL，立即轻柔颠倒混合采血管多次，混匀后4℃放置，将EDTA抗凝管分别包装，低温运输，4小时内进行血浆分离。4.根据权利要求2所述的PWS及AS的快速检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中采血卡采集的具体操作方法为：采集完血液后，滴加在采血卡上，待其晾干后进行运送。5.根据权利要求1所述的PWS及AS的快速检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中羊水采集的具体方法为：医生按标准采集后，专用包装保存，低温运输。6.根据权利要求1所述的PWS及AS的快速检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中唾液采集的具体方法为：待检者按唾液试子采集要求采集唾液样本，低温运输。7.根据权利要求1所述的PWS及AS的快速检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中DNA提取包括血斑DNA提取、全血DNA提取、羊水DNA提取、唾液DNA提取中的至少一种。8.根据权利要求1所述的PWS及AS的快速检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中提取DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞晓敏，杨丽萍，吴欢，罗旌万，
申请(专利权)人：俞晓敏，杭州甄元健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11