一种成人型多囊肾的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种成人型多囊肾的检测方法，采用长片段PCR捕获+二代测序+一代验证的方法，检测并验证成人型多囊肾致病基因PKD1、PKD2的治病突变。较现有探针捕获技术而言，可以区分真假基因，特异性捕获真基因，减少假基因带来的干扰；优化各组分比例，保证捕获的均一性，避免出现数据均一性差，部分片段数据量不足的情况；优化后的建库方案稳定性好，便于进行自动化建库；现有分析方法经过测试，能很好的处理检测结果，找到正确的结果。

Method for detecting adult type polycystic kidney

The invention relates to a method for detecting adult polycystic kidney, and uses a long fragment PCR capture + two generation sequencing + a generation verification method to detect and verify the therapeutic mutation of the adult polycystic kidney disease causing genes PKD1 and PKD2. Compared with the existing probe capture technology, can distinguish between true and false gene specific capture true gene, reduce the interference of pseudogenes brought; optimal proportion of each component, to ensure the uniformity of capture, avoid data uniformity, a fragment of the amount of data is insufficient; the database scheme stability after optimization, to facilitate automated database; the existing analysis method after the test, can handle a good detection result, find the correct result.

【技术实现步骤摘要】
一种成人型多囊肾的检测方法
本专利技术属于遗传病基因检测
，涉及一种成人型多囊肾的检测方法。
技术介绍
多囊肾是一种常见的遗传性肾病，主要表现为双侧肾脏出现多个大小不一的囊肿，囊肿进行性增大占位，挤压正常肾单位，破坏肾脏的结构和功能，最终导致终末期肾病。该病临床常表现为多发性肾脏囊肿、进行性肾功能衰竭、持续性高血压和泌尿系感染等症状，还可合并其他器官囊肿(肝囊肿、胰腺囊、卵巢囊肿等)，脑血管畸形，动脉瘤，心脏瓣膜病变，门脉高压等多种并发症。由于目前缺乏有效治疗手段，多数患者发展为终末期肾衰而不得不进行肾脏替代治疗或肾移植手术。目前现有技术中采用的探针捕获技术或普通长片段扩增，但是都存在假基因的干扰或随机突变等问题，随机突变率高，特异性低，检测结果可靠性低。专利申请号为CN201610005746.0的专利技术专利公开了一种通过靶向高通量半导体测序技术检测多囊肾致病基因突变的DNA文库及其应用。具体来说，根据6个多囊肾病致病基因，设计引物池，对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增，扩增产物利用高通量半导体测序技术进行测序，寻找致病突变，明确多囊肾的遗传学病因，为临床诊断提供遗传学和分子生物学的理论依据,为多囊肾患者晚期移植手术供体鉴别提供支持，为多囊肾患者进行选择性优生优育提供基础。该专利技术涉及6个基因检测区域能够检测常染色体显性多囊肾和常染色体隐性多囊肾，但是并没有提供详细快速的检测方法。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术提供一种成人型多囊肾的检测方法，采用长片段特异扩增技术，可以避免假基因、复杂模板的干扰，得到特异的目标片段。长片段序列建库在基因组建库的基础上，通过调整试验参数，完成二代测序文库构建，可以一次性完成测序结果，便于流程化检测多囊肾的实现。测序结果分析流程基于SNP分析流程，通过参数调整，使之完成适合本检测方法的准确检测，能够快速找出有效突变信息，并对其作出致病性判读，直接给出二代测序检测报告。同时，一代测序可以验证致病突变二代测序检出结果是否正确，从而保证检测结果的可靠性，满足应用与临床检测的各个要求，便于规范化批量样本检测，并给出可靠的检测结果。本专利技术提供了如下的技术方案：一种成人型多囊肾的检测方法，包括以下步骤：(1).长片段PCR，PCR产物电泳质检；(2).PCR产物回收、纯化；(3).构建文库；(4).RT-PCR定量；(5).测序；(6).信息分析。(7).一代测序验证(8).检测报告。优选的是，所述步骤(2)中PCR产物回收、纯化的具体方法为：将PCR产物按1:1混匀，向混合物中加入0.1×积分数的ProteinaseK，振荡混匀，离心，室温孵育，加入AMPureXP磁珠，混匀后离心，孵育后，将离心管置于磁力架上，待溶液澄清，吸弃上清液，加入乙醇，待溶液澄清后，丢弃上清液，重复多次，室温晾干磁珠。加入NF·H2O振荡混匀，室温孵育后，离心，待溶液澄清，吸取上清液，测定浓度后保存备用。上述任一方案优选的是，所述步骤(3)中构建文库具体包括片段化；富集；长度分选、纯化；电泳质检。上述任一方案优选的是，所述片段化的具体方法为：取纯化后混合产物解冻，在PCR管中加入各反应组分吹打混匀，进行PCR反应；涡旋振荡混匀AMPureXP磁珠并吸取至EP管中，把片段化产物移入离心管中，吹打混匀，室温孵育；将反应管离心后分离磁珠和液体，移除上清液；保持离心管始终处于磁力架中，漂洗磁珠，于室温孵育后移除上清，室温晾干，加入NF·H2O洗脱，吹打混匀，室温孵育，离心后分离磁珠和溶液，待溶液澄清吸取上清至PCR管中。上述任一方案优选的是，所述长度分选、纯化的具体方法为：振荡混匀AMPureXP磁珠并吸取部分至EP管中，然后把起始PCR产物移入离心管中，轻轻吹打充分混匀，室温孵育；将离心管离心后分离磁珠和溶液，转移上清液至干净离心管中，振荡混匀AMPureXP磁珠，吸取部分至上清液中，轻轻吹打充分混匀，室温孵育；将离心管离心后分离磁珠和溶液，弃上清；加入乙醇漂洗磁珠，于室温孵育后移除上清；室温晾干，加入NF·H2O洗脱，充分混匀，室温孵育；离心后分离磁珠和溶液，吸澄清溶液至灭菌PCR管中。上述任一方案优选的是，所述步骤(4)RT-PCR定量包括以下步骤：(6.1).配置qPCR体系和重复的反应体系，每个样本两次重复；(6.2).稀释样本文库：取2μl测试样本文库，用无核酶水在低吸附试管内1:1000，分两次稀释，先1：10稀释，再1:100稀释；(6.3).PCR试剂放置冷冻试剂在冰盒内，充分混匀试剂，离心；(6.4).每个反应，吸取16μl的混合溶液到每个PCR反应管内；(6.5).加4μl的稀释标准文库和待测试文库到每个PCR反应管内；(6.6).加4μl无核酶水到没有模板反应管内作为阴性对照；(6.7).密封PCR管，简单离心收集样本并减少气泡生成；(6.8).运行实时定量PCR反应，计算文库的浓度。上述任一方案优选的是，所述步骤(5)中测序的方法为：对每个定量的文库进行稀释，并将稀释浓度相同的多个文库按照数据量比例混匀；任意二代测序仪按其上机测序要求完成操作，要求双端测序总测序长度>150bp，或单端>200bp，双index测序，数据量为0.5M。上述任一方案优选的是，所述步骤(6)中信息分析时通过BWA(Burrows–WheelerAlignment)软件将测得的序列与人类基因组参考序列进行比对，采用GATK(GenomeAnalysisToolKit)软件识别突变位点，并筛选出高质量结果，然后采用ANNOVAR综合注释软件对突变位点的人群频率，保守性和对蛋白结构和功能影响剧烈程度进行评估，进一步提取人群频率低,保守性高，对蛋白结构或功能有剧烈影响的突变，最后结合功能注释结果，频率注释和文献报道，按照ACMG突变位点致病性注释标准指南，对位点进行致病性注释，筛选出明确致病或可能致病的突变位点。上述任一方案优选的是，所述步骤(7)中一代测序进行验证的方法为：对二代测序检出突变点所在的片段进行长片段扩增，针对突变点设计验证引物，扩增完成后，用验证引物对二代测序检测突变点进行一代测序验证。上述任一方案优选的是，所述步骤(7)中检测报告至少包括：病人基本信息、样本基本信息、二代测序检测结果、一代测序验证结果、疾病描述，突变点致病类型和参考文献。有益效果(1).本专利技术提供一种成人型多囊肾的检测方法，采用长片段特异扩增技术，可以避免假基因、复杂模板的干扰，得到特异的目标片段。相较于现有探针捕获技术，本专利技术可以排除假基因的干扰；普通长片段扩增由于体系的问题，会引入随机突变，本专利技术通过体系优化，得到的扩增产物经检测检测出1/10000的随机突变，明显低于优化前；普通长片段扩增会有较多的非特异扩增，本专利技术体系优化后特异性高，扩增条带单一，本专利技术的分析方法也确认捕获方案的可靠性，并未出现异于正常范围的突变数，实验及分析方法统一性好，利于数据解读。(2).本专利技术建库方案经过优化，可以得到最优的检测方案，文库片段及捕获片段均一性等方面能很好满足测序分析的需要。(3).本专利技术的分析方法可以通过设置的阈值排除扩增引入随机突变，提高分析结果准确性；本专利技术建立了多囊肾检测突变位点判读方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种成人型多囊肾的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：(1).长片段PCR，PCR产物电泳质检；(2).PCR产物回收、纯化；(3).构建文库；(4).RT‑PCR定量；(5).测序；(6).信息分析；(7).一代测序验证；(8).检测报告。

【技术特征摘要】
1.一种成人型多囊肾的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：(1).长片段PCR，PCR产物电泳质检；(2).PCR产物回收、纯化；(3).构建文库；(4).RT-PCR定量；(5).测序；(6).信息分析；(7).一代测序验证；(8).检测报告。2.根据权利要求1所述的成人型多囊肾的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中PCR产物回收、纯化的具体方法为：将PCR产物按1:1混匀，向混合物中加入0.1×积分数的ProteinaseK，振荡混匀，离心，室温孵育，加入AMPureXP磁珠，混匀后离心，孵育后，将离心管置于磁力架上，待溶液澄清，吸弃上清液，加入乙醇，待溶液澄清后，丢弃上清液，重复多次，室温晾干磁珠。加入NF·H2O振荡混匀，室温孵育后，离心，待溶液澄清，吸取上清液，测定浓度后保存备用。3.根据权利要求1所述的成人型多囊肾的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中构建文库具体包括片段化；富集；长度分选、纯化；电泳质检。4.根据权利要求3所述的成人型多囊肾的检测方法，其特征在于：所述片段化的具体方法为：取纯化后混合产物解冻，在PCR管中加入各反应组分吹打混匀，进行PCR反应；涡旋振荡混匀AMPureXP磁珠并吸取至EP管中，把片段化产物移入离心管中，吹打混匀，室温孵育；将反应管离心后分离磁珠和液体，移除上清液；保持离心管始终处于磁力架中，漂洗磁珠，于室温孵育后移除上清，室温晾干，加入NF·H2O洗脱，吹打混匀，室温孵育，离心后分离磁珠和溶液，待溶液澄清吸取上清至PCR管中。5.根据权利要求3所述的成人型多囊肾的检测方法，其特征在于：所述长度分选、纯化的具体方法为：振荡混匀AMPureXP磁珠并吸取部分至EP管中，然后把起始PCR产物移入离心管中，轻轻吹打充分混匀，室温孵育；将离心管离心后分离磁珠和溶液，转移上清液至干净离心管中，振荡混匀AMPureXP磁珠，吸取部分至上清液中，轻轻吹打充分混匀，室温孵育；将离心管离心后分离磁珠和溶液，弃上清；加入乙醇漂洗磁珠，于室温孵育后移除上清；室温晾干，加入NF·H2O洗脱，充分混匀，室温孵育；离心后分离磁珠和溶液，吸澄清溶液至灭菌PCR管中。6.根据权利要求1所述的成人型多囊肾的检测方法，其特征在于：所述步骤(4)RT-PCR定量...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞晓敏，杨丽萍，侯敏，罗旌万，饶欢，
申请(专利权)人：俞晓敏，杭州甄元健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11