微生物抗药性的质谱快速检测制造技术

本发明专利技术涉及用于测定微生物对抗生素的抗药性的方法和仪器，所述微生物特别是产生β‑内酰胺酶的微生物。通过在质谱样品载板上培养与一定剂量的合适的抗生素(例如β‑内酰胺抗生素亚胺培南)混合的少量微生物，然后以质谱法直接测量微生物酶对抗生素的分解，所述方法在一个小时内即可测定微生物的抗药性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物对抗生素的抗药性的测定，所述微生物特别是产生β-内酰胺酶的那些微生物。
技术介绍
出版物WO 2011154517A1(M.Kostrzewa、K.Michelmann和K.Sparbier)及同族出版物DE 102010023452B4和US 20130095511A1介绍了一种微生物β-内酰胺酶抗药性测定方法，其基于质谱测量微生物β-内酰胺酶对β-内酰胺抗生素(或具有相似结构的底物)的酶催化改变。为此，向含有β-内酰胺抗生素(或具有相似结构的底物)的溶液中引入细菌，并进行培养例如大约三小时。然后优选通过离心或过滤分离细菌。之后将一至两微升不含细菌的溶液施加至质谱样品载板上，干燥并包被基质溶液以进行基质辅助激光解吸电离(MALDI)。在具有MALDI离子源的飞行时间质谱仪中测量生成质谱，可通过它来确定是否存在经酶催化改变的抗生素或底物，特别是β-内酰胺环的水解分裂，这表示微生物具有抗药性。在出版物WO 2012/023845A1(Luider等人)中介绍了一种类似方法，其大体上通过质谱测定微生物酶导致的抗生素的改变。这些文件所述的方法都有较多的单独步骤，特别是离心或过滤，这既需要很长时间，通常又涉及人工操作过程。已知方法通常需要三个小时左右。对于工作量更小、更易于自动化且速度更快、能够以较少样品数量产生高样品通量的微生物抗药性测定方法，始终存在需求。
技术实现思路
本专利技术的目的本专利技术目的是提供这样的方法和仪器，通过该方法和仪器，可以通过质谱，只使用很少的单独步骤，优选在一个小时内，测定基于抗生素的酶催化改变的微生物抗药性。专利技术简述本专利技术提供一种用于测定微生物样品对抗生素的抗药性方法，其中在样品载板的测试点上在一定体积的液体中将所述微生物样品和所述抗生素混合，并且在所述测试点上通过质谱测量分析所述抗生素是否经酶催化改变。质谱测量的质量范围优选小于1000道尔顿，特别是介于250至750道尔顿。抗生素可以是选自青霉素类(苄青霉素、口服青霉素(oral penicillins)、氨基青霉素、异恶酰基青霉素(isoxacylpenicillins)、酰氨基青霉素)、头孢菌素类、单环β-内酰胺类或碳青霉烯类的组中的β-内酰胺抗生素。微生物样品还可以与包含β-内酰胺抗生素和β-内酰胺酶抑制剂的复方药品混合，所述复方药品例如克拉维酸与阿莫西林的组合、他佐巴坦与哌拉西林的组合、或舒巴坦与β-内酰胺抗生素的组合。微生物样品还可以在测试点上与多于一种抗生素混合。例如可通过由相应的质量信号所显示出的抗生素减少或一种或多种分解产物的增多，或二者，来测定抗生素的酶催化改变。特别地，可通过与参考物质的质量信号进行比较来确定抗生素的减少。在这种情况中，在微生物样品与抗生素混合之前，测试点可以已经包被有参考物质。还可以在它们混合之后或在制备适合质谱测量的样品(例如MALDI样品)期间添加参考物质。在优选实施方案中，在具有MALDI离子源的质谱仪(特别是飞行时间质谱仪)中进行质谱测量，其中质谱样品载板是平的并具有多个测试点。在另一实施方案中，微生物样品优选具有完整的微生物细胞。在根据本专利技术的方法中，微生物细胞在一定体积的液体中的培养期小于一小时，例如优选仅约半小时。在一定体积的液体中的培养优选在室温下进行。施加至测试点上的微生物细胞的数目优选介于103至107。当使用完整的微生物细胞时，在制备用于质谱测量的样品期间，
特别是制备MALDI样品期间，微生物细胞仍保持完整(即未被消化)是有利的。微生物样品可包括取自平板培养基(例如琼脂平板)的菌落的完整微生物细胞，或通过离心或过滤从液体培养基分离出的完整微生物细胞。特别地，液体营养基可以是阳性血液营养基，其中血细胞优选在离心或过滤前被破坏。微生物样品还可以是未经培养的体液样品，例如血液样品、尿液样品、或脊髓液样品或涂片样品。涂片样品是取自伤口或粘膜(口、鼻、尿道、阴道、肛门)表面的用于分析的内源物质。在另一实施方案中，微生物样品包括被消化的微生物细胞(细胞裂解产物)，在这种情况中，也可在测试点进行微生物消化。如果通过在测试点制备MALDI样品来消化微生物样品中的完整微生物细胞，或者如果微生物样品是细胞裂解产物，那么在质谱测量中还可采集微生物蛋白质的质量信号。这些信号还可用于微生物分类学鉴定和/或在其抗药性方面对其进行进一步表征。微生物样品还可通过以下方法获得，使用不含任何抗生素的液体对平板培养基上的菌落进行微生物细胞采样，然后将样品液体(作为微生物样品)与样品载板上的抗生素混合。在另一实施方案中，测试点上的所述一定体积的液体小于10微升，优选小于5微升，特别是介于1至3微升。在样品载板的测试点上混合微生物样品和抗生素之后，样品载板优选保持在潮湿环境中，或向测试点添加额外的液体，以防止所述一定体积的液体在指定培养期或反应时间内干燥殆尽。此外，本专利技术还提供了用于微生物样品的抗药性质谱测定的样品载板，其中所述样品载板具有多个测试点，并且至少一个测试点包被有一定剂量的一种或多种抗生素。不同的测试点可以包被有不同的抗生素。此外，每个测试点还可包被有一种或多种参考物质。原则上，可以使用任何质谱仪进行质谱测量，例如四极过滤器(特别是三重四极质谱仪)、正交离子注入飞行时间质谱仪(OTOF)、离子回旋共振质谱仪(ICR-MS)、静电Kingdon质谱仪或离子阱质谱
仪。特别有利的是，使用目前常用于鉴定微生物(特别是细菌)、并且通常在线性模式下运行且无反射器的相同MALDI飞行时间质谱仪。本专利技术优点在于，仅使用少量微生物和少量体积的液体，只需要很少的简单的单独步骤，特别是非常快速。特别地，根据本专利技术的方法使得不需要通过离心或过滤从一定体积的液体中分离出微生物细胞，即可实现抗药性质谱测定。附图说明图1上方的MALDI质谱显示亚胺培南的质量信号，其在与β-内酰胺酶阴性株系孵育后尚未分解(由箭头标出)。下方的MALDI质谱示出在样品载板上与β-内酰胺酶阳性株系孵育半小时后，亚胺培南的质量信号消失。竖线示出参考物质的位置。图2为示出六个β-内酰胺酶阳性株系和两个β-内酰胺酶阴性株系的商logRQ的箱线图，各阳性株系的logRQ>0.4，各阴性株系的logRQ<0.2。示出了多次测量的中位数和跨度(spread)。图3示例性示出了微量滴定板大小的具有96个测试点(10)的样品载板，其包被有一定剂量的抗生素。对于其他类型的质谱仪，也有不同的样品载板(通常更小)。特别有利的是其测试点(10)具有嵌入疏水环境中的亲水表面的样品载板。所加入的任何液体即会自动流到测试点边缘。具体实施方式通过以下方法可以快速容易地对许多微生物种类，特别是细菌、古生菌和单细胞真菌，进行质谱鉴定，所述方法为从以普通方法培养的菌落或营养培养基中的菌落取少量微生物，将其转移到质谱样品载板上，在其上用基质溶液消化，干燥，通过基质辅助激光解吸电离进行质谱测量。使用在各情况中包含大约40至80种蛋白质(质量范围通常介于3000至20000道尔顿)的谱图，通过与数千个参考谱进行近似度分析，来确定微生物种类。这里所用术语“鉴定”视为表示系统
分类，即确定其科、属和种，可能还有亚种。同时还有本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于测定微生物样品对抗生素的抗药性的方法，其中在样品载板的测试点上在一定体积的液体中将所述微生物样品和所述抗生素混合，并且在所述测试点上通过质谱测量进行分析，从而确定所述抗生素是否经酶催化改变。

【技术特征摘要】
2015.04.13 EP 15163322.91.一种用于测定微生物样品对抗生素的抗药性的方法，其中在样品载板的测试点上在一定体积的液体中将所述微生物样品和所述抗生素混合，并且在所述测试点上通过质谱测量进行分析，从而确定所述抗生素是否经酶催化改变。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物样品含有完整的微生物细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其中在所述一定体积的液体中的培养期小于一个小时。4.根据权利要求2或3所述的方法，其中在室温下进行在所述一定体积的液体中的培养。5.根据权利要求2至4所述的方法，其中对每个测试点施加103个至107个微生物细胞。6.根据权利要求2至5所述的方法，其中在所述微生物不被消化的条件下，在所述测试点上制备用于基质辅助激光解吸电离的测量样品。7.根据权利要求2至6之一所述的方法，包括以下步骤：(a)提供样品载板，所述样品载板至少在一个测试点上具有包含一定剂量的所述抗生素的层；(b)将所述完整的微生物细胞施加至所述抗生素的层上，并且施加所述液体；(c)在所述测试点上进行培养；(d)干燥；(e)制备用于基质辅助激光解吸电离(MALDI)的测量样品；(f)在具有MALDI离子源的质谱仪中进行质谱的测量；和(g)评估所述质谱以鉴定抗药性。8.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：卡特里·斯帕比尔，贝娅特丽克丝·韦格曼，
申请(专利权)人：布鲁克道尔顿有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE