小麦光腥黑粉菌原生质体的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种小麦光腥黑粉菌原生质体的制备方法，包括如下步骤：(1)菌丝培养：将小麦光腥黑粉菌的冬孢子在水琼脂培养基中培养6‑9天后，用灭菌蒸馏水冲洗下来，收集菌液，离心去上清，得到菌丝；(2)细胞壁裂解：以氯化钾溶液作为渗透压稳定剂，配制混合酶液，加入菌丝中，28℃振荡酶解1.5‑2.5h，即得到小麦光腥黑粉菌原生质体；所述混合酶液包括质量百分比浓度为1.5％的崩溃酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蜗牛酶。采用所述方法制备小麦光腥黑粉菌原生质体，产量高达17.0×10

Method for preparing wheat light black fungus protoplast

The invention relates to a preparation method of a kind of Tilletia foetida protoplasts, which comprises the following steps: (1) Mycelium Culture: the teliospores of Tilletia foetida in water agar after 9 days of culture medium with 6, distilled water washed down, collecting bacteria liquid, centrifugal to clearly, get mycelium; (2) cell wall lysis as osmotic stabilizer with potassium chloride solution, mixed enzyme solution, adding the mycelia, 1.5 28 C 2.5h oscillation enzyme to obtain Tilletia foetida protoplast; the mixed enzyme solution including the mass percent concentration of lywallzyme and 1.5% snail enzyme 1.5%, 1.5% driselase. The protoplast of wheat light smut fungus is prepared by adopting the method, and the yield is up to 17 * 10

【技术实现步骤摘要】
小麦光腥黑粉菌原生质体的制备方法
本专利技术涉及细胞工程中真菌原生质体制备与再生
，具体涉及一种小麦光腥黑粉菌原生质体的制备方法。
技术介绍
小麦光腥黑粉菌(TilletiafoetidaWalle.Lindr.)引起的小麦光腥黑穗病(commonbuntofwheat)是一种世界性病害，具有分布广泛、流行性强，危害严重等特点，严重影响小麦的生产。感病植株通常在外观上没有明显的症状，在发病后期，颖壳略向外张开，整个麦穗变成病穗，病粒外有一层灰色薄膜，内部充满黑粉，是病原菌的冬孢子，冬孢子有鱼腥味，引起小麦产量和品质降低。小麦光腥黑粉菌属于担子菌亚门(Basidiomycotina)、冬孢菌纲(Teliomycetes)、黑粉菌目(Ustilaginales)、腥黑粉菌科(Tilletiaceae)、腥黑粉菌属(Tilletia)。冬孢子呈褐色，球形或近球形，可随种子传播，在土壤中能够存活多年，一旦条件适宜并遇到大面积的寄主植物，便会引起发病。国内外对于小麦光腥黑穗病的研究主要集中在病原菌生物学特性以及分子标记技术，对该病原菌的致病机制研究较少。遗传转化技术是实现大规模定点突变的重要方法，利用该技术能够改变真菌的遗传物质，研究植物病原菌的的致病机理。目前，真菌遗传转化的方法有很多，常见的有聚乙二醇介导的原生质体转化、限制性内切酶介导的整合以及农杆菌转化等。原生质体是大多数转化方法的受体细胞，因此原生质体的制备和再生直接关系到转化能否顺利进行。获得产率高、可再生的小麦光腥黑粉菌原生质体的制备方法，将为建立该病原菌的遗传转化体系奠定基础，推动对该病原菌致病机制的研究。
技术实现思路
针对上述领域存在的需求，本专利技术的目的在于提供一种小麦光腥黑粉菌原生质体的制备方法。本专利技术通过如下技术方案实现：小麦光腥黑粉菌原生质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)菌丝培养：将小麦光腥黑粉菌的冬孢子在水琼脂培养基中培养6-9天后，用灭菌蒸馏水冲洗下来，收集菌液，离心去上清，得到菌丝；(2)细胞壁裂解：以氯化钾溶液作为渗透压稳定剂，配制混合酶液，加入菌丝中，28℃振荡酶解1.5-2.5h，即得到小麦光腥黑粉菌原生质体；所述混合酶液包括质量百分比浓度为1.5％的崩溃酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蜗牛酶。优选地，所述水琼脂培养基的制备方法为：称取20g琼脂粉，加水定容到1L，高压蒸汽灭菌。优选地，所述小麦光腥黑粉菌冬孢子在水琼脂培养基中培养7天。优选地，所述氯化钾溶液的浓度为1.2mol/L。优选地，所述28℃振荡酶解的时间为2h。优选地，所述混合酶液与所述菌丝的配比为20ml：1g。优选地，所述振荡酶解在180r/min的转速下进行。优选地，所述小麦光腥黑粉菌的冬孢子在水琼脂培养基中培养的条件为温度为16℃和相对湿度为80％。原生质体是许多真菌进行遗传转化的受体细胞，优化原生质体的制备方法，能更好的建立小麦光腥黑粉菌的遗传转化体系。本专利技术以小麦光腥黑粉菌菌株为供试材料，研究了菌株培养时间、细胞壁裂解酶、酶解时间和渗透压稳定剂等对原生质体制备的影响，获得了小麦光腥黑粉菌原生质体制备的最佳条件。菌龄：制备真菌的原生质体一般都采用新鲜的菌丝或孢子，细胞壁的结构和成分在不同的生长时期会有所不同。小麦光腥黑粉菌冬孢子萌发后先产生先菌丝和初生担孢子，之后初生担孢子H结合产生侵染菌丝，侵染菌丝既对小麦有侵染性，又容易被酶解。培养时间过短，产生的先菌丝和担孢子相对比较幼嫩，在原生质体释放后容易受到酶的作用而破裂，降低原生质体得率；培养时间过长，菌丝细胞壁老化、成分改变，酶系统对其作用不显著，原生质体得率较低。因此，小麦光腥黑粉菌冬孢子的培养时间直接影响原生质体数量。本专利技术实验结果表明，在水琼脂培养基中培养7天的小麦光腥黑粉菌最适宜制备原生质体，产生的原生质体数量最多。裂解酶及酶解时间：真菌细胞壁成分复杂多样，在原生质体制备中，用于裂解细胞壁的酶的种类及酶解时间，对原生质体产出率有非常重要的影响。酶解时间过短，细胞壁破解不完全，许多原生质体不能从菌丝上分离下来，使原生质体产率降低；时间过长，酶对得到的原生质膜伤害作用过大，容易造成原生质体的破裂，也会降低原生质体的产率。担子菌菌丝的细胞壁主要成分是几丁质和葡聚糖。本专利技术采用崩溃酶、溶壁酶和蜗牛酶对小麦光腥黑粉菌细胞壁进行溶解实验，其中崩溃酶是含有木聚糖酶、昆布多糖酶、及纤维素酶等的复合酶；溶壁酶具有几丁质酶、纤维素酶及蛋白酶等活性；蜗牛酶中含有纤维素酶、果胶酶、葡糖酸酶、几丁质酶和脂酶等多种酶。结果表明，一种酶或者两种酶都不能很好地溶解小麦光腥黑粉菌细胞壁，本专利技术采用质量浓度为1.5％的崩溃酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蜗牛酶的复合酶液，在28℃振荡条件下对菌体细胞壁酶解2h后，获得的原生质体产率最高。渗透压稳定剂：渗透压稳定剂可以保护细胞膜使其不受裂解酶过度破坏，对原生质体起到保护作用，能影响原生质体的制备和再生。渗透压稳定剂通常包括有机和无机两种，针对不同的真菌，作用效果不同。本专利技术研究发现，以1.2mol/L的KCl为渗透压稳定剂，所得的小麦光腥黑粉菌原生质体数量最多，且释放的原生质体能够均匀散乱分布，不聚集成堆。综上，采用本专利技术的方法制备小麦光腥黑粉菌原生质体，产量高达17.0×105～18.0×105个/mL，且释放的原生质体均匀散乱分布，不聚集成堆。得到的原生质体可以在TB3培养基上长出较多单菌落，可用于小麦光腥黑粉菌的原生质体再生。附图说明图1为小麦光腥黑粉菌原生质体的释放过程，其中，a：在酶解初始阶段，菌丝细胞开始向内凹陷成念珠状；b：随着酶解进行，细胞壁逐渐被降解，原生质体释放出来，呈圆形透明的小球；c：有的原生质体会连在一起；d：最后菌丝酶解完全，大量的原生质体释放出来。图2为菌龄对原生质体形成的影响，其中，横坐标为菌体的培养天数，纵坐标为原生质体数量(×105个/mL)。图3为不同酶解时间对原生质体产量的影响，其中，横坐标为酶解时间(小时)，纵坐标为原生质体数量(×105个/mL)。图4为不同渗透压稳定剂对原生质体产量的影响，其中，横坐标为不同的渗透压稳定剂，纵坐标为原生质体数量(×105个/mL)。图5为使用不同渗透压稳定剂制备的原生质体释放后的状态，其中，a：以山梨醇作为渗透压稳定剂，所释放的原生质体易聚集分布，箭头所示为原生质体；b：以蔗糖为渗透压稳定剂，很多原生质体聚集在一起，箭头所示为原生质体；c：以MgSO4为渗透压稳定剂，原生质体释放后分散分布，箭头所示为原生质体；d：以KCl为渗透压稳定剂，原生质体释放后分散分布，箭头所示为原生质体。图6为小麦光腥黑粉菌原生质体的再生，其中，左侧为TB3培养基，右侧为PDA培养基。具体实施方式下面结合具体实施例进一步描述本专利技术，需要理解的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何方式限制本专利技术的范围。生物材料小麦光腥黑粉菌：本专利技术所使用的小麦光腥黑粉菌为现有文献《小麦光腥黑穗菌萌发的超微结构研究》，西北农业大学学报，1999，03期(3)：110-112所记载的菌株。上述生物材料本实验室亦有保存，申请人声明可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。主要试剂溶壁酶(Lysingenzyme)，购于Sigm本文档来自技高网...

【技术保护点】
小麦光腥黑粉菌原生质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)菌丝培养：将小麦光腥黑粉菌的冬孢子在水琼脂培养基中培养6‑9天后，用灭菌蒸馏水冲洗下来，收集菌液，离心去上清，得到菌丝；(2)细胞壁裂解：以氯化钾溶液作为渗透压稳定剂，配制混合酶液，加入菌丝中，28℃振荡酶解1.5‑2.5h，即得到小麦光腥黑粉菌原生质体；所述混合酶液包括质量百分比浓度为1.5％的崩溃酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蜗牛酶。

【技术特征摘要】
1.小麦光腥黑粉菌原生质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)菌丝培养：将小麦光腥黑粉菌的冬孢子在水琼脂培养基中培养6-9天后，用灭菌蒸馏水冲洗下来，收集菌液，离心去上清，得到菌丝；(2)细胞壁裂解：以氯化钾溶液作为渗透压稳定剂，配制混合酶液，加入菌丝中，28℃振荡酶解1.5-2.5h，即得到小麦光腥黑粉菌原生质体；所述混合酶液包括质量百分比浓度为1.5％的崩溃酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蜗牛酶。2.根据权利要求1所述的小麦光腥黑粉菌原生质体的制备方法，其特征在于：所述水琼脂培养基的制备方法为：称取20g琼脂粉，加水定容到1L，高压蒸汽灭菌。3.根据权利要求1所述的小麦光腥黑粉菌原生质体的制备方法，其特征在于：所述小麦...

【专利技术属性】
技术研发人员：高利，沈慧敏，陈万权，刘太国，刘博，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11