一种生产头孢菌素C的重组菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种生产头孢菌素C的重组菌及其应用。该重组菌的制备方法如下：向出发菌中导入提高腺苷甲硫氨酸合成酶表达和/或活性的物质，得到重组菌。实验证明，采用该重组菌生产CPC，不仅培养基中省去了甲硫氨酸的添加，而且提高了CPC的产量。与出发菌株顶头孢霉CGMCC 3.3795相比，重组菌具有更强的CPC合成能力。本发明专利技术提供的重组菌在提高CPC的产量、降低生产成本等方面具有重要的应用价值。

Recombinant bacteria for producing cephalosporin C and application thereof

The invention discloses a recombinant bacterium for producing cephalosporin C and application thereof. The preparation method of the recombinant bacteria is as follows: the recombinant bacteria are obtained by introducing into the starter bacteria the expression and / or the activity of the S-adenosylmethionine synthetase. The experiment proved that using the recombinant strain to produce CPC, not only methionine was added to the medium, but also the yield of CPC was increased. With the starting strain cephalosporiumacremonium CGMCC 3.3795 compared to recombinant bacteria has stronger ability to synthesize CPC. The recombinant bacteria provided by the invention has important application value in improving the yield of CPC and reducing the production cost.

【技术实现步骤摘要】
一种生产头孢菌素C的重组菌及其应用
本专利技术涉及应用工业微生物领域，具体涉及一种生产头孢菌素C的重组菌及其应用。
技术介绍
头孢菌素C(CephalosporinC，CPC)是生产头孢类抗生素重要中间体7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的主要原料。目前，工业上主要利用顶头孢霉(Acremoniumchrysogenum)来发酵获得CPC。CPC在顶头孢霉中的生物合成途径已经基本研究清楚，且顶头孢霉的遗传操作系统相对成熟，这为利用基因工程手段定向改造这一重要的工业真菌奠定了良好的基础。甲硫氨酸能够显著刺激顶头孢霉中CPC的产生，长期以来一直作为顶头孢霉中CPC产生的促进剂，并已用于工业化生产当中。随着顶头孢霉CPC发酵水平的不断提高，甲硫氨酸成为影响CPC生产成本的一个重要因素。因此，在培养基中不添加甲硫氨酸时，获得仍可以提高CPC的发酵水平的菌株具有重要的应用价值。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何在培养基中不添加甲硫氨酸时仍可以提高CPC的发酵水平。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种重组菌。本专利技术所提供的重组菌，其制备方法可如下：提高出发菌中腺苷甲硫氨酸合成酶的含量和/或活性，得到重组菌。上述重组菌中，所述腺苷甲硫氨酸合成酶的氨基酸序列可如序列表的序列2所示。上述重组菌中，所述提高出发菌中腺苷甲硫氨酸合成酶的含量和/或活性的方法可为向出发菌中导入编码腺苷甲硫氨酸合成酶的核酸分子。上述重组菌中，所述“向出发菌中导入编码腺苷甲硫氨酸合成酶的核酸分子”可通过向出发菌中导入重组载体实现；所述重组载体可为向表达载体插入编码腺苷甲硫氨酸合成酶的核酸分子得到的重组质粒。上述任一所述重组菌中，所述出发菌可为顶头孢霉。所述顶头孢霉具体可为顶头孢霉CGMCC3.3795。上述任一所述编码腺苷甲硫氨酸合成酶的核酸分子具体可如序列表的序列1所示。上述任一所述编码腺苷甲硫氨酸合成酶的核酸分子也属于本专利技术的保护范围。含有上述任一所述编码腺苷甲硫氨酸合成酶的核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物也属于本专利技术的保护范围。所述表达盒可为表达盒A；所述表达盒A包括启动子、编码腺苷甲硫氨酸合成酶的核酸分子和终止子。所述启动子可为CaMV35S启动子、NOS启动子或OCS启动子。所述终止子可为NOS终止子或OCSpolyA终止子。所述表达盒A的核苷酸序列可如序列表的序列4所示。所述表达盒A中：序列表的序列4自5’末端起第1至2093位为启动子，第2109至3293位为编码腺苷甲硫氨酸合成酶的核酸分子，第3319至3838位为终止子。所述重组载体可为向表达载体插入编码腺苷甲硫氨酸合成酶的核酸分子得到的重组质粒。所述表达载体可为质粒pAg1-G418-P-T。所述重组载体具体可为重组质粒pAg1-AcsamsOE。所述重组质粒pAg1-AcsamsOE具体可为将质粒pAg1-G418-P-T的限制性内切酶PacI和AscI之间的小片段取代为序列表的序列1所示的DNA分子，得到的重组质粒。所述重组质粒pAg1-AcsamsOE表达序列表的序列2所示的腺苷甲硫氨酸合成酶。所述重组微生物可通过将所述重组载体导入出发微生物得到。所述出发微生物可为酵母、细菌、藻类或真菌。所述细菌可为革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。所述革兰氏阴性细菌可为根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)。所述根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)具体可为根瘤农杆菌AGL-1。所述重组微生物具体可为AGL-1/pAg1-AcsamsOE；AGL-1/pAg1-AcsamsOE是将重组质粒pAg1-AcsamsOE导入根瘤农杆菌AGL-1得到的重组农杆菌。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了一种菌剂，其含有上述任一所述的重组菌。上述任一所述的重组菌、或、上述任一所述编码腺苷甲硫氨酸合成酶的核酸分子、或、“含有上述任一所述编码腺苷甲硫氨酸合成酶的核酸分子核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物”、或、所述菌剂在生产头孢菌素C中的应用也属于本专利技术的保护范围。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了一种生产头孢菌素C的的方法，可包括发酵培养上述任一所述的重组菌，得到头孢菌素C的步骤。上述方法中，所述发酵培养使用的发酵培养基可为不含甲硫氨酸的培养基或含甲硫氨酸的培养基。所述发酵培养使用的发酵培养基具体可为原始MDFA发酵培养基或改良MDFA发酵培养基。所述发酵培养接种量为5％～15％(如5％～10％、10％～15％、5％、15％或10％)。所述发酵培养的培养条件为25℃～30℃(如25℃～28℃、28℃～30℃、25℃、30℃或28℃)培养100h～160h(如100h～120h、120h～144h、144h～160h、100h、120h、160h或144h)。上述方法中，所述“发酵培养所述重组菌”还可包括制备种子液。所述制备种子液的步骤如下：摇瓶培养所述重组菌，得到种子液。所述摇瓶培养使用的摇瓶培养基可为含甲硫氨酸的培养基。所述摇瓶培养使用的摇瓶培养基具体可为所述原始MDFA发酵培养基。所述摇瓶培养使用的摇瓶培养基具体可为所述改良MDFA发酵培养基。所述摇瓶培养中初始生物量为1×107cfu/40mL～5×107cfu/40mL(如1×107cfu/40mL～3×107cfu/40mL、3×107cfu/40mL～5×107cfu/40mL、1×107cfu/40mL、5×107cfu/40mL或3×107cfu/40mL)。所述摇瓶培养接种量为5％～15％(如5％～10％、10％～15％、5％、15％或10％)。所述摇瓶培养的培养条件为25～30℃(如25℃～28℃、28℃～30℃、25℃、30℃或28℃)、180rpm～260rpm(如180rpm～220rpm、220rpm～260rpm、180rpm、260rpm或220rpm)培养40h～60h(如40h～48h、48h～60h40h、60h或48h)。上述任一所述甲硫氨酸具体可为DL型甲硫氨酸。上述任一原始MDFA发酵培养基的制备方法可为：将蔗糖36g、DL型甲硫氨酸3.2g、L-天门冬酰胺7.5g、Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O0.16g、溶液Ⅰ20mL、溶液Ⅱ40mL、溶液Ⅲ144mL和溶液Ⅳ8mL溶于蒸馏水并用蒸馏水定容至1L，调节pH值为7.4。上述任一改良MDFA发酵培养基的制备方法可为：将蔗糖36g、L-天门冬酰胺7.5g、Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O0.16g、溶液Ⅰ20mL、溶液Ⅱ40mL、溶液Ⅲ144mL和溶液Ⅳ8mL溶于蒸馏水并用蒸馏水定容至1L，调节pH值为7.4，得到的培养基。实验证明，采用本专利技术提供的重组菌生产CPC，不仅培养基中省去了甲硫氨酸的添加，而且提高了CPC的产量。与出发菌株(即顶头孢霉CGMCC3.3795)相比，重组菌具有更强的CPC合成能力。本专利技术提供的重组菌在提高CPC的产量、降低生产成本等方面具有重要的应用价值。附图说明图1为构建重组质粒pAg1-AcsamsOE的示意图。图2为拟转AcsamsOE基因的转化子的鉴定。图3为甲硫氨酸对重组菌AcsamsOE-1生长的影响。图4为重组菌AcsamsOE-1的发酵本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组菌，其制备方法如下：提高出发菌中腺苷甲硫氨酸合成酶的含量和/或活性，得到重组菌。

【技术特征摘要】
1.一种重组菌，其制备方法如下：提高出发菌中腺苷甲硫氨酸合成酶的含量和/或活性，得到重组菌。2.如权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述出发菌为顶头孢霉。3.如权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于：所述腺苷甲硫氨酸合成酶的氨基酸序列如序列表的序列2所示。4.如权利要求1至3任一所述的重组菌，其特征在于：所述提高出发菌中腺苷甲硫氨酸合成酶的含量和/或活性的方法为向出发菌中导入编码腺苷甲硫氨酸合成酶的核酸分子。5.如权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述编码腺苷甲硫氨酸合成酶的核酸分子...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘钢，刘佳佳，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11