高产MonacolinK的红曲霉基因工程菌的构建方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种高产MonacolinK的红曲霉基因工程菌的构建方法及其应用，通过在红曲霉菌中过表达MonacolinK编码基因mok基因，获得高产MonacolinK的红曲霉基因工程菌。所述mok基因为mokC基因、mokD基因、mokE基因、mokI基因中的一种。利用本发明专利技术方法，可以增强红曲霉中MonacolinK的代谢途径，进而从根本上解决红曲霉次级代谢产物中MonacolinK产量低的问题。而且本发明专利技术工程菌可以降低桔霉素的含量，达到改善红曲产品质量、保证红曲产品的安全性的目的。

Construction method of Monascus gene engineering bacteria with high yield of MonacolinK and application thereof

The invention provides a method for constructing gene engineering strains of Monascus a high yield of MonacolinK and its application, through the over expression of MonacolinK gene encoding Mok gene in Monascus, Monascus gene engineering bacteria to obtain high yield of MonacolinK. The Mok gene is one of the mokC gene, mokD gene, mokE gene, and mokI gene. The method of the invention can enhance the metabolic pathway of MonacolinK in Monascus, and thereby fundamentally solve the problem of low yield of MonacolinK in the secondary metabolite of monascus. Moreover, the engineering bacteria of the invention can reduce the content of citrinin, thereby improving the quality of the Monascus products and ensuring the safety of the red yeast products.

【技术实现步骤摘要】
高产MonacolinK的红曲霉基因工程菌的构建方法及其应用
本专利技术属于微生物基因工程
，涉及高产MonacolinK的红曲霉基因工程菌的构建方法及其应用。
技术介绍
红曲霉(MonascuspurpureusWent.)中文别名红曲、红糟、红大米，存在于树木、土壤和堆积物等。是我国重要的微生物资源，能产生广泛的具有生物活性的天然产物，具有很高的商业价值。红曲霉生长适应的温度范围很广，一般温度15～42℃，最适温度为25～30℃，生长最适pH值为3.5～5，可耐浓度高达10％的乙醇。在麦芽汁琼脂培养基上生长良好，菌落初为白色，老熟后变成淡粉色、紫色或灰黑色，多形成红色。红曲的应用已有上千年的历史，其医疗功效在中国古籍中早有记载，可用于酿酒、制醋、做豆腐乳的着色剂和调味剂，也可做中药。现有研究表明，红曲具有降血脂、降血压、抗氧化、抗癌、抗菌、抗疲劳、预防老年痴呆症等多重功效。Monacolins是红曲霉的主要代谢产物之一。研究表明MonacolinK(又称Lovastain、mevinollin和Mewacor)是一种抑制胆固醇合成的药物，最初由日本学者远藤章于1979年从红曲霉的次级代谢产物中发现。MonacolinK具有抑制胆固醇合成系统中的限制酶3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(HMG-CoA)活性，从而降低人体和动物血浆中的胆固醇水平，是良好的血脂调节物质。此外，MonacolinK还具有抑制肿瘤、预防和治疗动脉硬化、冠心病、高血压、肥胖症等的作用。目前，MonacolinK主要是以红曲霉通过固态发酵或液态发酵的方式进行生产。菌株产目标物质的能力是影响微生物发酵生产功能性物质的产量的首要因素。因此，需要不断的研究筛选出高产目的产物的菌株。基因工程菌是获得高产目标产物菌株的一个重要手段。目前，还没有采用基因工程的方法获得高产MonacolinK的红曲霉的相关报道。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种高产MonacolinK的红曲霉基因工程菌的构建方法及其应用，利用本专利技术方法，可以增强红曲霉中MonacolinK的代谢途径，进而从根本上解决红曲霉次级代谢产物中MonacolinK产量低的问题。不仅如此，本专利技术还意外发现，本专利技术工程菌可以降低桔霉素的含量，达到改善红曲产品质量、保证红曲产品的安全性的目的。为实现上述目标，因此，本专利技术第一方面，提供一种高产MonacolinK的红曲霉基因工程菌的构建方法，通过在红曲霉菌中过表达MonacolinK编码基因mok基因，获得高产MonacolinK的红曲霉基因工程菌。所述mok基因为mokC基因、mokD基因、mokE基因、mokI基因中的一种。所述mokC、mokD、mokE、mokI基因的碱基序列分别如SEQIDNO.1至SEQIDNO.4所示。进一步，所述红曲霉菌为低产桔霉素红曲霉菌。具体的，本专利技术高产MonacolinK的红曲霉基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：(1)以红曲霉cDNA为模板，用特异引物扩增MonacolinK编码基因mok基因片段；(2)构建红曲霉M1的MonacolinK基因的克隆质粒载体pBC-Hygro-mok(mokC/mokD/mokE/mokI)；(3)将构建好的质粒电击转化进入红曲霉感受态细胞中，潮霉素B抗性筛选转基因菌株。所述步骤(1)特异引物序列上游引物和下游引物分别带有酶切位点，引物序列如表1所示的SEQIDNO.5-SEQIDNO.12：表1.特异性引物表另一方面，本专利技术还提供了所构建的高产MonacolinK的红曲霉基因工程菌在发酵获得高产量、低桔霉素的MonacolinK的用途。MonacolinK的产量较出发菌红曲霉最高提高2.3倍，而桔霉素含量低于0.25μg/L。本专利技术具有如下有益效果：(1)本专利技术成功扩增到mok的mokC、mokD、mokE、mokI四个基因片段。我们在研究中发现以cDNA为模板，设计能够完整扩增目的条带、并且两端包含合适的酶切位点的特异性引物十分困难。专利技术人经过反复引物设计-合成-PCR测序结果验证，才获得了本专利技术表1所用的4对特异性引物。(2)本专利技术成功构建红曲霉M1的MonacolinK基因的克隆载体pBC-Hygro-mok。本专利技术通过特异性引物的设计，可成功酶切pBC-Hygro和mokC/mokD/mokE/mokI片段，然后连接后获得重组质粒，本专利技术方法方便、高效。(3)本专利技术采用基于原生质体的电击转化介导红曲霉M1的MonacolinK基因过表达方法，可一次转入大量质粒，不会影响到红曲霉基因组序列长度和碱基序列。实践中发现，当前热门的REMI转化方法并不适用于本专利技术，因为REMI转化不能够将质粒切开后连接于红曲霉基因的DNA上。经过大量研究和筛查，最终确定采用本专利技术提供的电击转化的方法和条件。(4)本专利技术所得基因工程菌产MonacolinK能力强，产MonacolinK的能力比其出发菌红曲霉最高提高2.3倍。(5)本专利技术所得基因工程菌在高产MonacolinK的同时，将桔霉素含量降低至0.25μg/L以下，远低于国标中相关规定(液态样品中桔霉素的定量限为50μg/L，对固态样品中桔霉素的定量限为1mg/kg)。进而保证红曲产品的安全性，达到改善红曲产品质量的目的。附图说明图1为过表达质粒pBC-hygro-mok的构建技术路线示意图(以pBC-hygro-mokC为例)。图2为紫色红曲霉M1转录组RNA的琼脂糖凝胶电泳图；M：DL2000DNAMarker；泳道1-3：紫色红曲霉M1转录组RNA。图3为目标基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；M：DL2000DNAMarker；泳道1-3：mokC基因的PCR产物。图4为目标基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；M：DL2000DNAMarker；泳道1-5：mokD基因的PCR产物。图5为目标基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；M：DL2000DNAMarker；泳道1-5：mokE基因的PCR产物。图6为目标基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；M：DL2000DNAMarker；泳道1-5：mokI基因的PCR产物。图7为重组质粒pBC-hygro-mokC酶切验证的琼脂糖凝胶电泳图；M：DL10000DNAMarker；泳道1：pBC-hygro-mokC/QuickCutSmaI+QuickCutNotI；泳道2：pBC-hygro/QuickCutSmaI+QuickCutNotI。图8为重组质粒pBC-hygro-mokD酶切验证的琼脂糖凝胶电泳图；M：DL10000DNAMarker；泳道1：pBC-hygro-mokC/QuickCutSmaI+QuickCutNotI；泳道2：pBC-hygro/QuickCutSmaI+QuickCutNotI。图9为重组质粒pBC-hygro-mokE酶切验证的琼脂糖凝胶电泳图；M：DL10000DNAMarker；泳道1：pBC-hygro-mokC/QuickCutSmaI+QuickCutNotI；泳道2：pBC-hygro/QuickCutSmaI+QuickCutNotI。图10为重组质粒pBC-hygro-mokI酶切验证的琼本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高产MonacolinK的红曲霉基因工程菌的构建方法，其特征是，通过在红曲霉菌中过表达MonacolinK编码基因mok基因，获得高产MonacolinK的红曲霉基因工程菌；所述mok基因为mokC基因、mokD基因、mokE基因、mokI基因中的一种。

【技术特征摘要】
1.一种高产MonacolinK的红曲霉基因工程菌的构建方法，其特征是，通过在红曲霉菌中过表达MonacolinK编码基因mok基因，获得高产MonacolinK的红曲霉基因工程菌；所述mok基因为mokC基因、mokD基因、mokE基因、mokI基因中的一种。2.如权利要求1所述的高产MonacolinK的红曲霉基因工程菌的构建方法，其特征是，所述mok基因用带有酶切位点的特异引物扩增得到；所述特异引物序列如SEQIDNO.5—SEQIDNO.12所示。3.如权利要求1或2任一所述的高产MonacolinK的红曲霉基因工程菌的构建方法，其特征是，包括如下步骤：(1)以红曲霉cDNA为模板，用特异引物扩增MonacolinK编码基因mok基因片段；(2)构建红曲霉M1的MonacolinK基因的克隆质粒载体pBC-Hygro-...

【专利技术属性】
技术研发人员：张婵，王成涛，孙宝国，梁健，柴诗缘，
申请(专利权)人：北京工商大学，
类型：发明
国别省市：北京,11