一种提高幽门螺杆菌致病菌株抗体检出率的改性胶乳免疫比浊测定试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种提高幽门致病菌株抗体检出率的改性胶乳免疫比浊试剂盒，该试剂盒由分别放置的试剂1，试剂2、校准品、低值质控品和高值质控品组成。通过前期对幽门螺杆菌菌株进行分型鉴定，提高了致病性菌株的检出率；抗原包被过程中选用4‑(4,6‑二甲氧基三嗪‑2‑基)‑4‑甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)作为超支化聚缩水甘油醚修饰的胶乳微球与抗原结合的交联剂，在增加偶联效率的同时利用超支化聚缩水甘油醚的亲水特性保护偶联抗原构象，提高抗原抗体特异性结合；试剂配制过程中选择了一种新型的表面活性剂十二烷基葡萄糖苷，在与其他活性剂、稳定剂、保护剂及防腐剂的共同作用下，有效提高了试剂脂类杂质及杂质蛋白清除能力。

【技术实现步骤摘要】
一种提高幽门螺杆菌致病菌株抗体检出率的改性胶乳免疫比浊测定试剂盒
本专利技术属医学检验
，涉及一种提高幽门螺杆菌致病菌株抗体检出率的改性胶乳免疫比浊测定试剂盒。
技术介绍
幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,简称H.pylori)是一种单极，多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的细菌，呈格兰染色阴性，在胃粘膜上皮细胞表面常呈典型的螺旋状或弧形。幽门螺杆菌是胃癌高危因子之一。1994年世界卫生组织/国际癌症研究机构(WHO/IARC)将其定为I类致癌原。流行病学显示，全球几乎有一半的人口感染此菌，发展中国家甚至高达60％～70％。因此，幽门螺杆菌感染是世界各国需要面对的公共卫生问题。幽门螺杆菌主要分为两种亚型，其中I型表达VacA，CagA等基因，被认为是导致胃部疾病的主要类型。而I型中的东亚型(EAS)导致胃癌的比例更高，相比未感染人群，发病率可高出20倍。目前幽门螺杆菌从检测手段上分为侵入性和非侵入性两大类。侵入法虽然检测准确，但此项检测一般需要进入病人胃部，给患者带来较大痛苦；且该类方法操作复杂，检测周期较长，不利于疾病的快速诊断；因此不适用于幽门螺杆菌的早期诊断与治疗。非侵入性检测避免了因反复做胃镜带来的痛苦或发生的其它类型的感染，试验方法主要有尿素呼吸试验和血清学法。尿素呼吸试验虽然灵敏度高，且可实现定量测定，但有一定的放射危害，且检测费用昂贵。血清学法中的酶联免疫、免疫印迹法和胶体金法虽提供了便捷手段，但检测速度慢且不利于大批量检测。胶乳免疫比浊法检测幽门螺杆菌不仅简便、快速、可实现批量检测，而且是定量检测的血清学法，由于该方法在幽门螺杆菌检测中的诸多优点，引发了国内广泛的研究热潮，目前国内已公布的专利技术专利如下：但该方法目前仍存在以下技术缺陷：1)与临床通用诊断标准比较敏感度，特异性及精确度较低；2)交联剂及胶乳微球在抗原交联过程中的稳定性、特异性及偶联效率仍有待改进；3)试剂中保护剂、稳定剂及表面活性剂的选用、配比及与微球的协同作用直接影响检测的试剂的灵敏度，线性，特异性及试剂稳定性；为便于临床推广及确保检测结果的可信度，需要进一步提高现有技术的灵敏度，线性，特异性及稳定性。
技术实现思路
本专利技术为了克服上述现有技术缺陷，提供了一种高幽门螺杆菌致病菌抗体检出率，特异性强，稳定性好，灵敏度高，线性范围广的幽门螺杆菌致病菌株抗体测定试剂盒，以及试剂盒的制备方法。本专利技术采取的技术方案是：通过将前期分型的东亚幽门螺杆菌菌株抗原结合于改性后的胶乳颗粒上提高血清中的幽门致病菌抗体检测率及抗原抗体结合的特异性。本专利技术是通过以下措施实现的：幽门螺杆菌致病菌株抗体测定试剂盒，包含试剂1、试剂2、校准品、低值质控品和高值质控品；其各组分及浓度范围为：试剂1：试剂2：校准品：低值/高值质控品：所述特异性东亚幽门螺杆菌抗原为东亚幽门螺杆菌全菌体蛋白抗原。所述改性胶乳颗粒为超支化聚缩水甘油醚修饰的聚苯乙烯乳胶，由粒径为50nm～80nm和粒径为250nm～300nm两种微粒组成。基蛋生物科技股份有限公司在其专利技术专利“超支化聚缩水甘油醚修饰胶乳微球增强免疫比浊法及其应用”中公开了一种超支化聚缩水甘油醚修饰的聚苯乙烯乳胶的制备及其在胶乳增强免疫比浊法中的应用；该专利技术采用的聚缩水甘油醚的活化相对复杂，且其采用单粒径胶乳微粒，无法同时满足试剂对灵敏度及线性的较高需求。本专利技术首次将该胶乳微粒运用于幽门螺杆菌测试中，且采用丁二酸酐(Suc)进行修饰得到含有大量羧基的超支化聚缩水甘油醚。操作相对简单，易于控制。由于本专利技术对线性及灵敏度的较高需求，本专利技术经过反复探索选用粒径为50nm～80nm和粒径为250nm～300nm两种微粒。本专利技术所述东亚幽门螺杆菌抗原的制备包括如下步骤：1)从幽门螺杆菌患者中分离出幽门螺杆菌；2)对分离出的幽门螺杆菌做CagA和VacA的PCR并测序；3)根据测序结果筛选出东亚菌株；4)对东亚菌株进行扩大培养；5)细胞破碎，离心，提取上清，纯化及蛋白浓度测定。在具体实施例中，公开了一种制备东亚幽门螺杆菌抗原的方法。本专利技术中，所述特异性东亚幽门螺杆菌抗原包被的胶乳颗粒制备方法如下：1)胶乳微球的修饰：将超支化聚缩水甘油醚溶解于吡啶中，用丁二酸酐(Suc)进行修饰得到含有大量羧基的超支化聚缩水甘油醚。2)胶乳颗粒标记：用含1％甘油，0.01％十二烷基葡萄糖苷的10mmol/LpH7.4磷酸缓冲液将胶乳颗粒稀释成5mg/mL，按与超支化聚缩水甘油醚微球所含羧基的摩尔比1:3～5的比例加入4-(4，6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)，混匀活化5-10min；按与超支化聚缩水甘油醚羧基微球质量比：1:30～60加入待偶联抗原，37℃摇床孕育1h～3h；加入含有0.5％BSA，0.01％十二烷基葡萄糖苷，5％甘油及0.05％Proclin300的10mmol/LpH7.4磷酸缓冲液，37℃摇床封闭1h～3h；0.22μm滤膜过滤；将标记完成的乳胶颗粒分装成1mL/支，4℃保存。3)使用上述步骤分别对粒径为50nm～80nm和粒径为250nm～300nm的超支化聚缩水甘油醚修饰的聚苯乙烯乳胶进行标记；将标记后的胶乳进行混合，按质量体积百分比计，粒径为50nm～80nm的胶乳浓度为0.65％～0.85％，粒径为250nm～300nm的胶乳浓度为0.15％～0.35％，混合，4℃保存。本专利技术中所述的百分比浓度，如未进行特殊说明，均为质量体积百分比浓度，即100mL溶液中所含溶质的克数。本专利技术的有益效果：1)本专利技术前期对菌株进行分型鉴定，选用东亚幽门螺杆菌全菌体蛋白抗原，由于患者感染幽门螺杆菌后血清中会产生相应抗体，而且所感染的幽门螺杆菌类型不同，产生的抗体类型也不同；本专利技术通过前期分离制备致病东亚幽门螺杆菌菌株抗原的方法进而提高产品对致病菌感染人血清的敏感度；同时由于幽门螺杆菌本身变异较大，选用全菌体蛋白亦可避免因一种蛋白变异而造成的特异度降低。2)本专利技术选用两种粒径的超支化聚缩水甘油醚修饰的胶乳微球，在增加试剂线性及灵敏度的同时，利用超支化聚缩水甘油醚的亲水特性保护偶联抗原构象，提高抗原抗体特异性结合，同时通过稳定剂，保护剂与超支化聚缩水甘油醚的协同作用，增加了乳胶微粒的稳定性及抗原与微粒结合的稳定性及特异性3)胶乳颗粒标记过程中：选用含1％甘油，0.01％十二烷基葡萄糖苷的磷酸缓冲液稀释胶乳颗粒增加了胶乳颗粒的均匀度，避免胶乳颗粒自身的凝聚，缩短了后续的活化时间，同时改善了胶乳颗粒的包被量；选用4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)作为微球与抗原的交联剂，DMTMM与甘油及十二烷基葡萄糖苷的协同作用增加了抗原与微粒的偶联效率，提高了微粒包被的均一性；选用含有0.5％BSA，0.01％十二烷基葡萄糖苷，5％甘油的磷酸缓冲液作为封闭液，减少了非特异性蛋白的交联，提高了抗原与微球结合的稳定性及特异性；该标记过程相对简单易于操作，确保了抗原标记的特异性、稳定性及均一性。4)通过大量实验筛选尝试，选择了一种新型的表面活性剂十二烷基葡萄糖苷；该活性剂与TRITONX-100协同作用，提高了脂类杂质清除的效力，减少了脂类杂质的干扰；同时提高了稳定剂BSA的稳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高幽门致病菌株抗体检出率的改性胶乳免疫比浊试剂盒，包含试剂1、试剂2、校准品、低值质控品和高值质控品，其各组分及浓度范围为：试剂1：

【技术特征摘要】
1.一种提高幽门致病菌株抗体检出率的改性胶乳免疫比浊试剂盒，包含试剂1、试剂2、校准品、低值质控品和高值质控品，其各组分及浓度范围为：试剂1：试剂2：校准品：低值/高值质控品：2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述特异性东亚幽门螺杆菌抗原包括东亚幽门螺杆菌全菌体蛋白抗原。3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述改性胶乳颗粒为超支化聚缩水甘油醚修饰的聚苯乙烯乳胶，由粒径为50nm～80nm和粒径为250nm～300nm两种微粒组成。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述的东亚幽门螺杆菌抗原是由如下步骤制备而成：1)从幽门螺杆菌患者中分离出幽门螺杆菌；2)对分离出的幽门螺杆菌做CagA和VacA的PCR并测序；3)根据测序结果筛选出东亚菌株；4)对东亚菌株进行扩大培养；5)细胞破碎，离心，提取上清，纯化及蛋白浓度测定。5.如权利要求2或4所述的试剂盒，其特征在于所述特异性东亚幽门螺杆菌抗原包被的改性胶乳颗粒制备方法如下：1)胶乳微球的修饰：将超支化聚缩水甘油醚溶解于吡啶中，用丁二酸酐(Suc)进行修饰得到含有大...

【专利技术属性】
技术研发人员：李雪，潘玥，许泼实，
申请(专利权)人：北京万泰德瑞诊断技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11