肿瘤特异性基因表达盒及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种肿瘤特异性基因表达盒，其包括依次连接的启动子、目的基因和终止子，其中，所述启动子的序列为序列表中SEQ?ID?No.1所示的序列。该基因表达盒含有如序列表中SEQ?ID?No.1所述的基因序列，特异性强且活性高，能有效识别肿瘤位点，从而为肿瘤治疗提供新途径。此外，本发明专利技术还涉及一种基因表达盒的构建方法以及含有该基因表达盒的重组表达载体及应用。

【技术实现步骤摘要】
肿瘤特异性基因表达盒及其构建方法和应用
本专利技术涉及肿瘤治疗领域，尤其是涉及一种肿瘤特异性基因表达盒及其构建方法和应用。
技术介绍
近些年来的大量研究证实，肿瘤发生与发展的生物学基础是基因突变。因此，肿瘤的基因治疗已成为目前肿瘤学研究的热点。肿瘤的基因治疗包括:祀向癌基因和/或肿瘤抑制基因的基因治疗(癌基因的作用被抑制或变性的肿瘤抑制基因被重新激活〉、自杀基因治疗(将人类细胞中本来不存在的药物代谢酶基因引入到肿瘤细胞中，然后给予该酶激活的癌症治疗的前药来只杀死引入药物代谢酶基因的细胞)、免疫学基因治疗(将细胞因子基因等引入到细胞以增强人体的免疫学功能并因此来治疗癌症)等。在上述基因治疗中，目的基因在肿瘤细胞或肿瘤组织中的特异性表达对基因治疗的效率和安全性有着重要的意义，也是目前基因治疗所遇到的挑战之一。为了能实现该基因在肿瘤的特异性表达，开发能以肿瘤特异性方式表达的启动子非常重要。作为肿瘤特异性启动子，已知的有端粒酶 启动子、甲胎蛋白(八--)启动子、癌胚抗原(⑶八)启动子以及前列腺特异性抗原启动子等。然而这些启动子由于其能应用的范围有限，并且启动子的转录活性不高，缺乏适应性。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种具有较高转录活性的肿瘤特异性基因表达盒及其构建方法和应用。`一种肿瘤特异性基因表达盒，包括依次连接的启动子、目的基因和终止子，其中，所述启动子的序列为序列表中320 10 ^0.1所示的序列。在其中一个实施例中，所述目的基因为自杀基因、细胞因子基因、离子通道基因、受体基因及细胞凋亡基因中的至少一种基因。在其中一个实施例中，所述肿瘤特异性基因表达盒还包括位于所述目的基因与所述终止子之间的标记基因。在其中一个实施例中，所述标记基因为内部核糖体进入位点序列和/或荧光蛋白基因序列。在其中一个实施例中，所述终止子为猴空泡病毒？017八终止子，序列为序列表中820 10如.2所示的序列。一种重组表达载体，包含上述任一实施例所述的肿瘤特异性基因表达盒。在其中一个实施例中，所述重组表达载体为质粒或病毒载体。在其中一个实施例中，所述病毒载体为慢病毒载体、腺相关病毒载体或腺病毒载体。上述任一实施例所述的基因表达盒在制备治疗肿瘤药物或诊断试剂中的应用。一种基因表达盒的制备方法，包括如下步骤:扩增启动子序列，所述启动子序列如序列表中320 10如.1所示，并在所述启动子序列的两端分别连接上第一和第二限制性内切酶位点序列；将扩增的含有第一和第二限制性内切酶位点序列的启动子连接到表达载体上，所述表达载体上含有所述第一和第二限制性内切酶位点序列；扩增含有第二和第三限制性内切酶位点序列的目的基因，并使用第二和第三限制性内切酶酶切含有启动子的所述表达载体，连接扩增的目的基因与第二和第三限制性内切酶酶切后得到的表达载体，得到含有启动子-目的基因序列的表达载体，其中，所述表达载体上含有所述第三限制性内切酶位点序列；在所述含有启动子-目的基因序列的表达载体的目的基因序列末端加上终止子序列，得到结构含有启动子-目的基因-终止子的基因表达盒。上述肿瘤特异性基因表达盒含有如序列表中320 10价).1所述的基因序列，特异性强且转录活性高，能有效识别肿瘤位点，从而为肿瘤治疗提供新途径。【专利附图】【附图说明】图1为本专利技术一实施方式的肿瘤特异性基因表达盒的结构示意图；图2为本专利技术一实施方式的肿瘤特异性基因表达盒的构建方法流程图；图3为本专利技术的启动子、I现1、及^启动子在人横纹肌肉瘤细胞株即，人乳腺癌细胞株1(^-7，人胰腺癌细胞株八3？01，人宫颈癌细胞株册“中的转录活性比较；图4为本专利技术的启动子`、I现1、及0^启动子在人胶质瘤细胞株口87、口373、口251中的转录活性比较；图5为本专利技术的启动子及0^启动子在小鼠体内的转录活性比较。【具体实施方式】下面主要结合附图及具体实施例对本专利技术的肿瘤特异性基因表达盒及其构建方法和应用作进一步详细的说明。如图1所示，一实施方式的肿瘤特异性基因表达盒，包括依次连接的启动子、目的基因、标记基因和终止子。本实施方式基因表达盒中的启动子为肿瘤特异性启动子，具有如序列表中320 10^0.1所示的基因序列，记为0？08。目的基因可以为自杀基因、细胞因子基因、离子通道基因、受体基因及细胞凋亡基因中的至少一种基因。标记基因为内部核糖体进入位点序列和/或突光蛋白基因序列，其中，突光蛋白基因如可以为黄色突光蛋白(76110? ^11101-6806111:肝'?)或绿色突光蛋白(狀一一!！^11101-6806111:即01:6111，即？)基因等。可理解，在其他实施方式中，该基因表达盒可以不含有标记基因。终止子为猴空泡病毒？017八(87401)017八)终止子，序列为序列表中3即10 ^0.2所示的序列。该基因表达盒可以整合进质粒或病毒载体中得到重组表达载体，其中，病毒载体可以为慢病毒载体、腺相关病毒载体或腺病毒载体等。该基因表达盒或者含有该基因表达盒的重组表达载体可以用于制备治疗肿瘤的药物或诊断试剂，为肿瘤的特异性诊断和治疗提供新途径。此外，如图2所示，本专利技术还提供了一种基因表达盒的制备方法，其包括如下步骤:步骤3110，扩增启动子序列，启动子序列如序列表中320 10如.1所示，并在启动子序列的两端分别连接上第一和第二限制性内切酶位点序列。在一实施方式中，第一限制性内切酶位点可以为I位点，第二限制性内切酶位点可以为8孤1? I位点。扩增过程使用聚合酶链式反应扩增，两引物序列分别含有所述第一限制性内切酶位点和第二限制性内切酶位点，例如上游引物序列为序列表中320 10价).3所示，下游引物序列为序列表中320 10价).4所示。可理解，在其他实施方式中，第一限制性内切酶位点和第二限制性内切酶位点不限于此，且上游引物序列和下游引物序列也可以为其他对应序列。步骤3120，将扩增的含有第一和第二限制性内切酶位点序列的启动子连接到表达载体上，表达载体上含有第一和第二限制性内切酶位点序列。在本步骤中，还包括使用第一限制性内切酶和第二限制性内切酶酶切表达载体的步骤，然后将扩增的含有第一和第二限制性内切酶位点序列的启动子连接到酶切后的表达载体上，从而得到含有上述启动子序列的重组表达载体。在一实施方式中，本步骤所使用的表达载体可以为？16社1-2？匕载体等。1)161^1-2？匕载体上含有？狀I和8肅!I I限制性酶切位点。可理解，在其他实施方式中，表达载体也可以为其他与第一和第二限制性内切酶位点序列对应的表达载体，如当第一和第二限制性内切酶位点分别为0111(1 III与恥11 I限制性酶切位点时，表达载体可以为载体等。`步骤3130，扩增含有第二和第三限制性内切酶位点序列的目的基因，并使用第二和第三限制性内切酶酶切含有启动子的表达载体，连接扩增的目的基因与第二和第三限制性内切酶酶切后得到的表达载体，得到含有启动子-目的基因序列的表达载体，其中，表达载体上含有第三限制性内切酶位点序列。本步骤中所述的目的基因可以为自杀基因、细胞因子基因、离子通道基因、受体基因及细胞凋亡基因中的至少一种，如可以为让中的自杀基因等，相应地，可以使用第二限制性内切酶和第三限制性内切酶酶切让的基因序列，得到，目的基因序列。第三本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤特异性基因表达盒，其特征在于，包括依次连接的启动子、目的基因和终止子，其中，所述启动子的序列为序列表中320 10 ^0.1所示的序列。2.如权利要求1所述的肿瘤特异性基因表达盒，其特征在于，所述目的基因为自杀基因、细胞因子基因、离子通道基因、受体基因及细胞凋亡基因中的至少一种基因。3.如权利要求1或2所述的肿瘤特异性基因表达盒，其特征在于，还包括位于所述目的基因与所述终止子之间的标记基因。4.如权利要求3所述的肿瘤特异性基因表达盒，其特征在于，所述标记基因为内部核糖体进入位点序列和/或突光蛋白基因序列。5.如权利要求1所述的肿瘤特异性基因表达盒，其特征在于，所述终止子为猴空泡病毒？017八终止子，序列为序列表中320 10如.2所示的序列。6.—种重组表达载体，其特征在于，包含如权利要求1~5中任一项所述的肿瘤特异性基因表达盒。7.如权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为质粒或病毒载体。8.如权利要求7所述的重组表...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟宝进，潘建青，王浩，宋伟健，
申请(专利权)人：深圳市南山区人民医院，
类型：发明
国别省市：