猪GM‑CSF蛋白的制备方法及其注射液和应用技术

本发明专利技术公开了一种猪GM‑CSF蛋白的制备方法及其注射液和应用，该方法包括以下步骤：1)将密码子优化后的猪GM‑CSF基因序列克隆到原核表达质粒中，得到重组质粒；2)将步骤1)中重组质粒转化大肠杆菌，得到阳性克隆；3)将步骤2)中阳性克隆进行发酵，诱导表达含有伴侣蛋白及相应酶切位点的猪GM‑CSF重组融合蛋白，得到含有伴侣蛋白及相应酶切位点的猪GM‑CSF重组融合蛋白；4)纯化步骤3)中猪GM‑CSF重组融合蛋白；5)使用能够切开所述猪GM‑CSF重组融合蛋白中酶切位点的蛋白酶对纯化后的猪GM‑CSF重组融合蛋白进行酶切，得到酶切液；以及6)从步骤5)中的酶切液中纯化得到猪GM‑CSF蛋白。使用本发明专利技术的方法在制备猪GM‑CSF蛋白时具有产量高、易于纯化、成本低、适合大规模生产等优点，且本发明专利技术的注射液在治疗病猪时有非常好的疗效。

Method and application of injection and preparation of porcine GM CSF protein

The invention discloses a pig GM CSF protein preparation method and injection and application, the method comprises the following steps: 1) and porcine GM cloned CSF gene sequence of codon optimized prokaryotic expression plasmid, recombinant plasmid; 2) step 1) recombinant plasmid was transformed into E.coli, obtained positive clones; 3) in step 2) in positive clones for fermentation, induced the expression of porcine GM recombinant CSF containing chaperone protein and the corresponding restriction sites of the fusion protein, the pig GM recombinant CSF containing chaperone protein and the corresponding restriction sites of fusion protein; 4) purification step 3) in swine GM the recombinant CSF fusion protein; 5) can be used to cut the pig GM CSF recombinant fusion protein restriction sites of porcine GM protease purified recombinant CSF fusion protein was digested by enzyme digestion liquid; and 6) from step 5) in enzyme solution purification The pig GM CSF protein. Using the present method of preparation of porcine GM CSF protein when it is used in high yield, easy purification, low cost, suitable for mass production and other advantages, and the injection of the invention has very good curative effect in the treatment of disease in pigs.

【技术实现步骤摘要】
猪GM-CSF蛋白的制备方法及其注射液和应用
本专利技术涉及一种猪GM-CSF蛋白的制备方法和应用，属于生物工程

技术介绍
细胞因子(cytokine，CK)是免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导多种细胞产生的低分子量可溶性蛋白质或多肽，通过与细胞表面的受体相互作用，从而具有调节固有免疫、适应性免疫、血细胞生成、细胞生长以及损伤组织修复等多种生物学功能。细胞因子分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。细胞因子在体内通过旁分泌、自分泌或内分泌等方式发挥作用，具有多效性、重叠性、拮抗性、协同性等多种生理特性。细胞因子不仅具有广泛的对疾病的治疗作用，还具有明显的免疫佐剂效应，可增强病毒疫苗、细菌疫苗和寄生虫疫苗的保护效应，特别是亚单位疫苗在增强刺激细胞免疫方面的作用。在进行造血细胞的体外研究中，发现一些细胞因子可刺激不同的造血干细胞在半固体培养基中形成细胞集落，这类因子被命名为集落刺激因子(colonystimulatingfactor，CSF)。根据集落刺激因子的作用范围，分别命名为粒细胞CSF(G-CSF)，巨噬细胞CSF(M-CSF)，粒细胞和巨噬细胞CSF(GM-CSF)，多能集落刺激因子(multi-CSF,又称IL-3)，干细胞因子(SCF)和红细胞生成素(EPO)。它们对不同发育阶段的造血干细胞起促增殖、分化的作用，是血细胞发生必不可少的刺激因子。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是由T细胞、B细胞、巨噬细胞、内皮细胞等在某些抗原和细胞因子作用下刺激产生的具有多种生物学活性的一类集落刺激因子。GM-CSF不仅能刺激造血细胞增殖、分化和成熟，并从骨髓向外周血转移，还能活化中性粒细胞、巨噬细胞及其他单核细胞。因此，GM-CSF在疾病治疗中有非常广泛的作用，目前在人医中已经广泛使用，但在猪用的药品中，还没有GM-CSF的产品，这是因为目前将人用的GM-CSF制备工艺放在猪用GM-CSF上面，整体复杂，成本高，不利于在兽用产品中推广和应用。另外，GM-CSF能通过促进包括树突状细胞在内的抗原递呈细胞的增殖分化，将其吸引到注射部位，增强抗原递呈能力，从而达到增强免疫效果的作用。因此GM-CSF还可以作为免疫佐剂或免疫增强剂，特别是在亚单位疫苗(因为亚单位疫苗在刺激细胞免疫方面的能力较弱)中，具有很广阔的发展前景。目前在猪GM-CSF的制备方面还没有报道，本实验室尝试了在真核表达系统中(包括昆虫杆状病毒、CHO细胞)和原核表达系统中单独表达GM-CSF，发现这2个真核系统中表达的GM-CSF产量很低，且蛋白很杂，考虑原因一是因为GM-CSF蛋白小，约17kDa，易降解，二是糖基化比较杂乱，导致分子量差异很大。而原核表达系统单独表达GM-CSF也存在产量低或检测无表达，究其原因一是因为GM-CSF蛋白小，可能容易降解，二是因为GM-CSF蛋白在大肠杆菌中表达时折叠错误，或形成包涵体，导致检测时没有发现表达。在蛋白类药物中，单独直接使用未经修饰的蛋白作为药物，在药代学上来看，药物的半衰期都很短，一般就几个小时。因此，为了延长药物的半衰期，一般都选择对目的蛋白进行修饰。但是，修饰都会极大的增加成本，不利于药物的推广，特别是在猪用药物中的推广。因此，研发一种可以适当延长半衰期且成本低的注射液是非常必要的，特别是在该药物的推广使用过程中。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题一是提供一种成本低、易于推广应用的猪GM-CSF蛋白的制备方法；二是克服常规技术中单独表达猪GM-CSF蛋白时由于分子量小而造成的产量低和易降解的问题；三是提供了一种可延长半衰期且成本低的注射液及其制备方法。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的制备方法，所述方法包括以下步骤：1)将密码子优化后的猪GM-CSF基因序列克隆到原核表达质粒中，得到重组质粒；所述原核表达质粒为可低温诱导表达目的蛋白且含有伴侣蛋白基因序列的质粒，所述克隆时在伴侣蛋白基因序列后面添加一种蛋白酶的酶切位点的基因序列；2)将步骤1)中所述重组质粒转化大肠杆菌，得到阳性克隆；3)将步骤2)中所述阳性克隆进行发酵，诱导表达含有伴侣蛋白及相应酶切位点的猪GM-CSF重组融合蛋白，得到含有伴侣蛋白及相应酶切位点的猪GM-CSF重组融合蛋白；4)纯化步骤3)中猪GM-CSF重组融合蛋白；5)使用能够切开所述猪GM-CSF重组融合蛋白中酶切位点的蛋白酶对纯化后的所述猪GM-CSF重组融合蛋白进行酶切，得到酶切液；以及6)从步骤5)中的酶切液中纯化得到猪GM-CSF蛋白。本专利技术的技术方案中，优选地，所述的密码子优化后的猪GM-CSF基因序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的技术方案中，所述的可低温诱导表达目的蛋白且含有伴侣蛋白基因的质粒为pCold-TF质粒或pColdProS2质粒，优选地，所述的可低温诱导表达目的蛋白且含有伴侣蛋白基因的质粒为pCold-TF质粒，所述的伴侣蛋白为TF蛋白。本专利技术的技术方案中，克隆时在伴侣蛋白基因序列后面添加的一种蛋白酶的酶切位点的基因序列为TEV蛋白酶的酶切位点的基因序列、HRV3C蛋白酶的酶切位点的基因序列、Thrombin蛋白酶的酶切位点的基因序列，优选地，克隆时在伴侣蛋白基因序列后面添加的一种酶的酶切位点的基因序列为TEV蛋白酶的酶切位点的基因序列，所述的TEV蛋白酶的酶切位点的基因序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术的技术方案中，优选地，所述猪GM-CSF蛋白为蛋白质(a)或蛋白质(b)：蛋白质(a)由SEQIDNO.4所示的氨基酸组成的蛋白质；蛋白质(b)在蛋白质(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有猪GM-CSF蛋白抗原性的由蛋白质(a)衍生的蛋白质。本专利技术的技术方案中，优选地，所述的转化的大肠杆菌为E.coliBL21(DE3)。本专利技术的技术方案中，优选地，所述的步骤3)中阳性克隆进行发酵时的培养基配制如下：4-1)发酵培养基组分1：YE：10g/L；胰蛋白胨：20g/L；KH2PO4:1.14g/L；K2HPO4:0.9g/L；(NH4)2SO4:3.0g/L；MgSO4·7H2O：0.3g/L，调节PH至6.8，定容至2.4L，与发酵罐体一起灭菌121℃，20min；4-2)发酵培养基组分2：甘油：终浓度30g/L，定容至0.45L，单独灭菌121℃，20min；4-3)发酵培养基组分3：VB1：6mg/mL，0.22μm滤膜过滤除菌；4-4)补料培养基组分1：YE：7.5g；胰蛋白胨：15g，定容至300mL，灭菌121℃，20min；4-5)补料培养基组分2：甘油：45g，定容至150mL，灭菌121℃，20min。本专利技术的技术方案中，优选地，所述的发酵包括以下步骤：5-1)设置参数：Agit：400RPM；Tempreture：37℃；PH：7.0；Air：100％；Gasflow：4.0；5-2)从补料口加入150μL消泡剂母液，加入发酵培养基组分2、1ml发酵培养基组分3、工作液浓度为50μg/ml的卡那霉素；5-3)溶氧电极标定：将DO电极与电极缆线断开连接，点开Calib界面，选中DO，在SetZe本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备猪GM‑CSF蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)将密码子优化后的猪GM‑CSF基因序列克隆到原核表达质粒中，得到重组质粒；所述原核表达质粒为可低温诱导表达目的蛋白且含有伴侣蛋白基因序列的质粒，所述克隆时在伴侣蛋白基因序列后面添加一种蛋白酶的酶切位点的基因序列；2)将步骤1)中所述重组质粒转化大肠杆菌，得到阳性克隆；3)将步骤2)中所述阳性克隆进行发酵，诱导表达含有伴侣蛋白及相应酶切位点的猪GM‑CSF重组融合蛋白，得到含有伴侣蛋白及相应酶切位点的猪GM‑CSF重组融合蛋白；4)纯化步骤3)中猪GM‑CSF重组融合蛋白；5)使用能够切开所述猪GM‑CSF重组融合蛋白中酶切位点的蛋白酶对纯化后的所述猪GM‑CSF重组融合蛋白进行酶切，得到酶切液；以及6)从步骤5)中的酶切液中纯化得到猪GM‑CSF蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种制备猪GM-CSF蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)将密码子优化后的猪GM-CSF基因序列克隆到原核表达质粒中，得到重组质粒；所述原核表达质粒为可低温诱导表达目的蛋白且含有伴侣蛋白基因序列的质粒，所述克隆时在伴侣蛋白基因序列后面添加一种蛋白酶的酶切位点的基因序列；2)将步骤1)中所述重组质粒转化大肠杆菌，得到阳性克隆；3)将步骤2)中所述阳性克隆进行发酵，诱导表达含有伴侣蛋白及相应酶切位点的猪GM-CSF重组融合蛋白，得到含有伴侣蛋白及相应酶切位点的猪GM-CSF重组融合蛋白；4)纯化步骤3)中猪GM-CSF重组融合蛋白；5)使用能够切开所述猪GM-CSF重组融合蛋白中酶切位点的蛋白酶对纯化后的所述猪GM-CSF重组融合蛋白进行酶切，得到酶切液；以及6)从步骤5)中的酶切液中纯化得到猪GM-CSF蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述密码子优化后的猪GM-CSF基因序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述可低温诱导表达目的蛋白且含有伴侣蛋白基因的质粒为pCold-TF质粒，所述伴侣蛋白为TF蛋白。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述克隆时在伴侣蛋白基因序列后面添加的一种蛋白酶的酶切位点的基因序列为TEV蛋白酶的酶切位点基因序列、HRV3C蛋白酶的酶切位点基因序列、Thrombin蛋白酶的酶切位点基因序列，所述TEV蛋白酶的酶切位点的基因序列如SEQIDNO.3所示。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述大肠杆菌为E.coliBL21(DE3)。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述阳性克隆进行发酵时的培养基配制如下：6-1)发酵培养基组分1：YE：10g/L；胰蛋白胨：20g/L；KH2PO4：1.14g/L；K2HPO4：0.9g/L；(NH4)2SO4：3.0g/L；MgSO4·7H2O：0.3g/L，调节PH至6.8，定容至2.4L，与发酵罐体一起灭菌121℃，20min；6-2)发酵培养基组分2：甘油：终浓度30g/L，定容至0.45L，单独灭菌121℃，20min；6-3)发酵培养基组分3：VB1：6mg/mL，0.22μm滤膜过滤除菌；6-4)补料培养基组分1：YE：7.5g；胰蛋白胨：15g，定容至300mL，灭菌121℃，20min；以及6-5)补料培养基组分2：甘油：45g，定容至150mL，灭...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱泓，吴有强，张强，徐玉兰，闻雪，姜冰洁，白志军，查银河，江海，
申请(专利权)人：浙江海隆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33