一种高通量检测柚皮素的方法技术

本发明专利技术公开了一种高通量检测柚皮素的方法，属于生物化学领域。本发明专利技术以AlCl3和MgOAc为助色基团，与柚皮素反应后可在激发光下显荧光，并可产生出一个新的紫外吸收峰，从而建立了一套柚皮素高通量检测方法。本发明专利技术检测准确度与高效液相色谱(HPLC)法检测结果相吻合，所述方法为黄酮类化合物生产菌株的高通量筛选提供了方便。

Method for high throughput detection of naringenin

The invention discloses a method for detecting naringenin by high throughput, belonging to the biochemistry field. The invention uses AlCl3 and MgOAc as auxiliary color groups and reacts with naringenin to display fluorescence under excitation light, and can generate a new ultraviolet absorption peak, thereby establishing a set of high throughput detection method for naringenin. The detection accuracy of the invention is identical with the result of the high performance liquid chromatography (HPLC) method, and the method provides convenience for the high throughput screening of the producing strains of flavonoids.

【技术实现步骤摘要】
一种高通量检测柚皮素的方法
本专利技术涉及一种高通量检测柚皮素的方法，属于生物化学领域。
技术介绍
黄酮类化合物具有广泛的功能，如抗炎症、抗衰老、抗癌、保肝护肝、调节人体激素水平和抗氧化等功能，已经被广泛的作为食品和药品的有效成分。黄酮类化合物是一类具有三个碳原子连接两个苯环所构成的复杂化合物，所以黄酮类化合物都具有一个共同的核心骨架，其不同之处在于核心骨架上连接的化学基团不同。柚皮素是一种二氢黄酮类化合物，独特的空间结构使得其成为了具有最多衍生物的黄酮骨架类物质。经过对柚皮素的后续化学或酶法催化修饰，适当的羟基化、甲基化、糖基化等催化反应，即可生成具有更高附加值和功能多样的黄酮类化合物。目前柚皮素生产的国际研究主要包括化学合成法、植物组织提取法和微生物合成法三种。然而由于化学反应极为复杂，反应条件剧烈，难以应用于食品和药品领域，具有生物活性的黄酮类化合物往往与其手性结构密切相关，因此化学合成方法难以实现廉价的大规模工业化生产。目前柚皮素的工业生产方法主要以橘子皮提取为主，然而，相比较于微生物法生产，提取同样法面临众多挑战：受季节限制严重，提取物来源不同可能存在重金属污染和农药残留，需要占用大量耕地，橘子皮中柚皮素含量低、杂质多等因素均导致柚皮素产量不高同时价格昂贵。近年来代谢工程和合成生物学的迅猛发展为微生物法高效生产柚皮素等黄酮类化合物提供了可能。然而微生物法生产柚皮素在目前的研究中依然面临诸多挑战。首先，筛选高效柚皮素等黄酮类化合物生产菌株和途径基因需要建立一套高通量检测方法。其次，植物来源的黄酮类化合物合成基因在微生物中表达往往无法实现高活性表达，因此利用随机突变高通量筛选策略筛选高活性基因迫在眉睫。然而，目前柚皮素等黄酮类化合物发酵产物检测主要依赖于前处理过程复杂、耗时严重的高效液相色谱(HPLC)检测方法。通过添加金属离子检测黄酮类化合物的光谱法检测方法普遍应用于检测植物提取物中的总黄酮含量，其检测环境较为纯净，在发酵液等复杂的检测体系中易受干扰，且针对柚皮素单一黄酮类化合物的最佳检测条件、检测金属离子和光谱学性质并无详细报道。目前缺少一套简单、快捷和抗干扰能力强的柚皮素等黄酮类化合物高通量检测方法用于发酵产品检测，这大大的限制了针对黄酮类化合物生产菌株的高通量改造实验的可行性。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种通过添加铝离子或镁离子作为助色基团检测柚皮素的方法。所述检测柚皮素的方法，是向待测样品中，添加铝离子，然后测定荧光强度或者在紫外光下检测吸收强度；或者，添加镁离子，然后测定荧光强度；对照标准曲线，确定待测样品中柚皮素的含量。所述待测样品，是生物法合成柚皮素得到的样品。包括以微生物发酵制备柚皮素时，得到的发酵上清液。所述以微生物发酵制备柚皮素，包括以大肠杆菌作为柚皮素生产菌株，以葡萄糖、或L-酪氨酸或者对香豆酸为底物发酵制备柚皮素。所述以微生物发酵制备柚皮素，包括以大肠杆菌作为柚皮素生产菌株，以MOPS或M9培养基为发酵培养基。所述添加铝离子，然后测定荧光强度，是以AlCl3为助色基团针对采用MOPS培养基为发酵培养基发酵得到的发酵上清液，于激发光波长382nm、发射光波长505nm条件下，测定荧光强度。所述添加铝离子，然后测定荧光强度，是以AlCl3为助色基团针对采用M9培养基为发酵培养基发酵得到的发酵上清液，于激发光波长374nm、发射光波长505nm条件下，测定荧光强度。所述添加铝离子，然后在紫外光下检测吸收强度，是以AlCl3为助色基团针对采用MOPS培养基为发酵培养基发酵得到的发酵上清液，于紫外检测波长为330～430nm范围内，例如373nm处检测吸收强度。所述添加镁离子，然后测定荧光强度，以MgOAc为助色基团针对采用MOPS培养基为发酵培养基发酵得到的发酵上清液，于激发光波长371nm、发射光波长492nm条件下，测定荧光强度。所述AlCl3在待测样品中的质量浓度为0.5～3％，优选2％。所述MgOAc在待测样品中的质量浓度为0.5～3％，优选1％。在本专利技术的一种实施方式中，荧光信号可利用多功能酶标仪、紫外-可见光分光光度计和流式细胞仪等可检测荧光信号或紫外吸收信号的仪器检测。在本专利技术的一种实施方式中，MgOAc和AlCl3等含有Mg2+和Al3+的助色基团可溶解于水、甲醇、乙醇、二甲基亚砜或上述的混合溶剂中，然后添加到待测样品中。在本专利技术的一种实施方式中，应用此方法检测的柚皮素可以作为黄酮类化合物生产过程中的中间代谢产物。本专利技术的有益之处：提供了一种简单快捷的柚皮素等黄酮类化合物检测方法，此方法利用了常见的无毒化学物质MgOAc和AlCl3等含有金属Mg2+和Al3+的化合物作为助色基团，Mg2+和Al3+离子与柚皮素等黄酮类化合物结合而生成一种络合物，此络合物可受激发光激发而产生荧光，此外其紫外-可见光吸收光谱亦会产生相应的变化，且荧光强度和紫外吸收强度与柚皮素等黄酮类化合物含量呈正比。此方法是首次建立的针对微生物发酵生产黄酮类化合物的高通量检测方法，为黄酮类化合物的微生物法生产提供了一个快速高效的检测方法。柚皮素等黄酮类化合物合成相关的酶学性质研究同样可采用此方法。与传统的高效液相色谱(HPLC)检测方法相比较，本方法最大的优势是检测效率高，无需样品前处理过程，可实现在多孔板中的高通量检测。基于此检测方法，未来诱变技术，随机突变方法以及其他的高通量改造策略均可应用于对柚皮素等黄酮类化合物微生物法生产。此方法为高通量改造微生物生产柚皮素等黄酮类化合物扫清了障碍。附图说明图1柚皮素、对香豆酸、L-酪氨酸的紫外-可见光光谱学特性。A-C：紫外-可见光光谱扫描在水溶液(A)、M9溶液(B)中和MOPS溶液(C)中的柚皮素、对香豆酸、L-酪氨酸。图2柚皮素、对香豆酸和L-酪氨酸的激发光光谱。A-E：在水(A)、1％AlCl3-MOPS溶液(B)、1％AlCl3-M9溶液(C)、1％MgOAc-MOPS溶液(D)、1％MgOAc-M9溶液(E)中的柚皮素、对香豆酸和L-酪氨酸荧光激发光谱。图3柚皮素、对香豆酸和L-酪氨酸的发射光光谱。A-E：在水(A)、1％AlCl3-MOPS溶液(B)、1％AlCl3-M9溶液(C)、1％MgOAc-MOPS溶液(D)、1％MgOAc-M9溶液(E)中的柚皮素、对香豆酸和L-酪氨酸荧光发射光谱。图4AlCl3、MgOAc和H3BO3作为助色基团时的柚皮素、对香豆酸和L-酪氨酸紫外-可见光全波长扫描光谱。A-C：在水中(A)、M9溶液(B)中和MOPS溶液(C)中以AlCl3作为助色基团时柚皮素、对香豆酸和L-酪氨酸的全波长扫描图谱；D-F：在水中(D)、M9溶液(E)中和MOPS溶液(F)中以MgOAc作为助色基团时柚皮素、对香豆酸和L-酪氨酸的全波长扫描图谱；G-I：在水中(G)、M9溶液(H)中和MOPS溶液(I)中以H3BO3作为助色基团时柚皮素、对香豆酸和L-酪氨酸的全波长扫描图谱。图5混合交叉实验。A：在2％AlCl3-MOPS溶液中382nm，激发505nm发射荧光检测柚皮素；B：在2％AlCl3-M9溶液中374nm，激发505nm发射荧光检测柚皮素；C：在1％MgOAc-MOPS溶液中371nm，激发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高通量检测柚皮素的方法，其特征在于，(1)向待测样品中，添加铝离子，然后测定荧光强度或者在紫外光下检测吸收强度；或者，添加镁离子，然后测定荧光强度；(2)对照标准曲线，确定待测样品中柚皮素的含量。

【技术特征摘要】
1.一种高通量检测柚皮素的方法，其特征在于，(1)向待测样品中，添加铝离子，然后测定荧光强度或者在紫外光下检测吸收强度；或者，添加镁离子，然后测定荧光强度；(2)对照标准曲线，确定待测样品中柚皮素的含量。2.根据权利要求1所述的一种高通量检测柚皮素的方法，其特征在于，所述待测样品，是生物法合成柚皮素得到的样品，包括以大肠杆菌作为柚皮素生产菌株，以葡萄糖、或L-酪氨酸或者对香豆酸为底物发酵制备柚皮素。3.根据权利要求2所述的一种高通量检测柚皮素的方法，其特征在于，所述待测样品，是以大肠杆菌作为柚皮素生产菌株，以MOPS或M9培养基为发酵培养基发酵得到的发酵上清液。4.根据权利要求1所述的一种高通量检测柚皮素的方法，其特征在于，所述添加铝离子，然后测定荧光强度，是以AlCl3为助色基团针对采用MOPS培养基为发酵培养基发酵得到的发酵上清液，于激发光波长382nm、发射光波长505nm条件下，测定荧光强度。5.根据权利要求1所述的一种高通量检测柚皮素的方法，其特征在于，所述添加铝离子，然后测定荧光强度，是以AlCl3为助色基团针对采用M9培养基为发酵培养基发酵...

【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，陈坚，周胜虎，堵国成，张娟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32