使用纳米孔和标签的核酸分子检测制造技术

本公开内容提供了在具有或疑似具有靶核酸分子的样品中测定靶核酸分子的存在的方法和系统。测定靶核酸分子的存在的方法包括促使样品流过邻近或靠近电极而设置的膜中的至少一个纳米孔，该电极在靶核酸分子移动穿过所述纳米孔时检测电流或电流变化。靶核酸分子如果存在的话可具有在其末端偶联的标签，该标签增加靶核酸分子在纳米孔中的停留时间。通过电流或电流变化测量基于靶核酸分子停留时间的增加来测定样品中靶核酸分子的存在。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用纳米孔和标签的核酸分子检测
技术介绍
可以使用例如基于热循环的方法(例如聚合酶链反应(PCR))或等温方法(例如环介导的等温扩增)来扩增核酸分子。可在核酸分子扩增的同时或之后检测扩增产物。这可以允许鉴定感兴趣的核酸序列，如单核苷酸多态性(SNP)、序列突变(包括例如缺失、插入、复制和易位)、罕见核酸分子/序列和样品中其他感兴趣的序列。此外，可以使用核酸扩增来制备用于核酸测序的核酸分子。
技术实现思路
尽管目前存在可用于核酸扩增和序列鉴定的方法和系统，但各种限制与这类方法相关联。一些核酸序列鉴定方法是昂贵的，并且可能不会在预期应用所需的时间框架内和/或准确度下足够快速地生成序列信息。在此认识到对能够进行序列鉴定的用于鉴定核酸扩增反应产物的改进方法存在需求。本公开内容提供了用于容易地测定生物样品中靶核酸序列或分子的存在或不存在的系统和方法。在一些实施方案中，可以在不获得靶核酸分子的核酸序列的情况下从信号(例如，电流或其变化)的连续测量检测靶核酸分子。本公开内容的一方面提供了一种在具有或疑似具有靶核酸分子的样品中测定靶核酸分子的存在的方法，该靶核酸分子在该靶核酸分子的末端与标签偶联。所述方法包括(a)促使样品流过邻近或靠近电极而设置的膜中的至少一个纳米孔，该电极适于在靶核酸分子移动穿过所述至少一个纳米孔时检测电流或其变化，其中所述移动花费的停留时间长于当靶核酸分子不与所述标签偶联时，靶核酸分子移动穿过所述至少一个纳米孔所花费的停留时间；(b)在促使所述样品流过所述至少一个纳米孔时，用所述电极测量电流或其变化；以及(c)根据(b)中测得的电流或其变化检测所述样品中的靶核酸分子，从而测定所述样品中靶核酸分子的存在。在一些实施方案中，所述标签是核酸分子。在一些实施方案中，该标签是具有至少5个连续核苷酸碱基的核酸分子。在一些实施方案中，该标签是具有至少10个连续核苷酸碱基的核酸分子。在一些实施方案中，该标签是具有至少20个连续核苷酸碱基的核酸分子。在一些实施方案中，该标签是包含可检测标记的分子。例如，该标签分子可以选自荧光素亚酰胺(FAM)和六氯荧光素(HEX)。在一些实施方案中，该标签是多肽。在一些实施方案中，该标签不是光学可检测的。在一些实施方案中，该标签在高于或等于80℃的温度下是稳定的。在一些实施方案中，该温度高于或等于约85℃。在一些实施方案中，该温度高于或等于约90℃。在一些实施方案中，该温度高于或等于约94℃。在一些实施方案中，所述方法进一步包括，在上文提及的步骤(a)之前进行以下步骤：(i)提供反应混合物，其包含具有或疑似具有模板核酸分子作为靶核酸分子的前体的生物样品，与该模板核酸分子互补的至少一种引物，和聚合酶，以及(ii)在产生所述样品中的靶核酸分子的条件下使所述反应混合物经历核酸扩增反应。在一些实施方案中，所述标签与所述至少一种引物偶联。在一些实施方案中，所述样品包含靶核酸分子，并且其中该靶核酸分子是作为所述扩增反应的扩增产物的多个拷贝中的拷贝。在一些实施方案中，所述引物是通用引物、人工引物或肽核酸。在一些实施方案中，所述核酸扩增反应是聚合酶链反应(PCR)。在一些实施方案中，所述核酸扩增反应是等温扩增。在一些实施方案中，该等温扩增是环介导的等温扩增(LAMP)。在一些实施方案中，所述至少一种引物包括至少两种引物。在一些实施方案中，上文提及的步骤(b)包括测量电流变化，该变化指示所述靶核酸分子的存在。在一些实施方案中，该电流变化是电流相对于时间的一阶导数(firstmomentofcurrentwithtime)。在一些实施方案中，在促使所述样品流过所述至少一个纳米孔之后测量电流。在一些实施方案中，所述标签与靶核酸分子不可逆地偶联。在一些实施方案中，所述至少一个纳米孔具有约0.5纳米(nm)至30nm的横截面尺寸。在一些实施方案中，该横截面尺寸为约2nm至15nm。在一些实施方案中，所述膜是固态膜。在一些实施方案中，该固态膜包含半导体或非金属。在一些实施方案中，该固态膜包含选自碳、硅、锗和砷化镓的材料。在一些实施方案中，该固态膜由石墨烯形成。在一些实施方案中，所述膜是脂双层。在一些实施方案中，所述至少一个纳米孔是所述膜中的成孔蛋白质。在一些实施方案中，该成孔蛋白质是α溶血素或MspA孔蛋白。在一些实施方案中，所述促使包括跨所述至少一个纳米孔施加电位。在一些实施方案中，该电位是可逆的。在一些实施方案中，该电位相对于参比为约1V至10V。在一些实施方案中，所述方法进一步包括跨所述至少一个纳米孔施加至少一个电位脉冲，以将靶核酸分子引导至和/或穿过所述至少一个纳米孔。在一些实施方案中，所述至少一个纳米孔邻近或靠近附加电极。在一些实施方案中，靶核酸分子通过以下步骤进行检测：(i)在所述样品流过至少一个纳米孔时测量电流或其变化，以及(ii)将该电流或其变化与参考值进行比较。在一些实施方案中，所述标签在所述标签与所述至少一个纳米孔相互作用后增加停留时间。在一些实施方案中，所述至少一个纳米孔包括多个纳米孔。在一些实施方案中，所述多个纳米孔是可单独寻址的。在一些实施方案中，在所述样品流过所述至少一个纳米孔时，在没有获得靶核酸分子的核酸序列的情况下，根据电流或其变化的连续测量检测靶核酸分子。在一些实施方案中，在指示存在靶核酸分子的停留时间时检测电流或其变化。在一些实施方案中，靶核酸分子包含至少5个连续的核苷酸碱基。在一些实施方案中，靶核酸分子包含至少10个连续的核苷酸碱基。在一些实施方案中，靶核酸分子包含至少20个连续的核苷酸碱基。在一些实施方案中，靶核酸分子是单链的。在一些实施方案中，靶核酸分子是双链的。在一些实施方案中，靶核酸分子是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。另一方面提供了一种用于在具有或疑似具有靶核酸分子的样品中测定靶核酸分子的存在的系统，该靶核酸分子包含至少5个连续的核苷酸碱基。所述系统包含：邻近或靠近电极而设置的膜中的至少一个纳米孔，其中该电极适于在样品流过所述至少一个纳米孔时检测电流；与所述至少一个纳米孔流体连通且适于保持所述样品的至少一个样品支持体；以及计算机处理器，其可操作地耦合至所述电极并被编程为(i)促使所述样品从所述至少一个样品支持体流过所述至少一个纳米孔，(ii)测量单个核酸分子在所述纳米孔中或穿过所述纳米孔的停留时间，以及(iii)当所述停留时间落入参考阈值之内时，将所述单个核酸分子鉴定为靶核酸分子。在一些实施方案中，所述计算机处理器被编程为测量所述单个核酸分子在所述纳米孔中或穿过所述纳米孔的第一停留时间，并且如果第一停留时间长于当靶核酸分子不与标签在靶核酸分子的末端偶联时，靶核酸分子在所述至少一个纳米孔中或穿过所述至少一个纳米孔的第二停留时间，则将所述单个核酸分子鉴定为靶核酸分子。一些实施方案中，该标签是核酸分子。在一些实施方案中，该标签是具有至少5个连续核苷酸碱基的核酸分子。在一些实施方案中，该标签是具有至少10个连续核苷酸碱基的核酸分子。在一些实施方案中，该标签是具有至少20个连续核苷酸碱基的核酸分子。在一些实施方案中，该标签是选自FAM和HEX的分子。在一些实施方案中，该标签是多肽。在一些实施方案中，该标签不是光学可检测的。在一些实施方案中，所述标签在高于本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在具有或疑似具有靶核酸分子的样品中测定所述靶核酸分子的存在的方法，所述靶核酸分子在所述靶核酸分子的末端与标签偶联，所述方法包括：(a)促使所述样品流过邻近或靠近电极而设置的膜中的至少一个纳米孔，该电极适于在所述靶核酸分子移动穿过所述至少一个纳米孔时检测电流或其变化，其中所述移动花费的停留时间长于当所述靶核酸分子不与所述标签偶联时，所述靶核酸分子移动穿过所述至少一个纳米孔所花费的停留时间；以及(b)在促使所述样品流过所述至少一个纳米孔时，用所述电极测量所述电流或其变化；以及(c)根据(b)中测得的所述电流或其变化检测所述样品中的所述靶核酸分子，从而测定所述样品中所述靶核酸分子的存在。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种在具有或疑似具有靶核酸分子的样品中测定所述靶核酸分子的存在的方法，所述靶核酸分子在所述靶核酸分子的末端与标签偶联，所述方法包括：(a)促使所述样品流过邻近或靠近电极而设置的膜中的至少一个纳米孔，该电极适于在所述靶核酸分子移动穿过所述至少一个纳米孔时检测电流或其变化，其中所述移动花费的停留时间长于当所述靶核酸分子不与所述标签偶联时，所述靶核酸分子移动穿过所述至少一个纳米孔所花费的停留时间；以及(b)在促使所述样品流过所述至少一个纳米孔时，用所述电极测量所述电流或其变化；以及(c)根据(b)中测得的所述电流或其变化检测所述样品中的所述靶核酸分子，从而测定所述样品中所述靶核酸分子的存在。2.根据权利要求1所述的方法，所述标签是核酸分子。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述标签是具有至少5个连续核苷酸碱基的核酸分子。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述标签是具有至少10个连续核苷酸碱基的核酸分子。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述标签是具有至少20个连续核苷酸碱基的核酸分子。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述标签是选自荧光素亚酰胺(FAM)和六氯荧光素(HEX)的分子。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述标签是多肽。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述标签不是光学可检测的。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述标签在高于或等于80℃的温度下是稳定的。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述温度高于或等于约85℃。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述温度高于或等于约90℃。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述温度高于或等于约94℃。13.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在(a)之前，(i)提供反应混合物，其包含具有或疑似具有模板核酸分子作为所述靶核酸分子的前体的生物样品，与所述模板核酸分子互补的至少一种引物，和聚合酶，以及(ii)在产生所述样品中的所述靶核酸分子的条件下使所述反应混合物经历核酸扩增反应。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述标签与所述至少一种引物偶联。15.根据权利要求13所述的方法，其中所述样品包含所述靶核酸分子，并且其中所述靶核酸分子是作为所述扩增反应的扩增产物的多个拷贝中的拷贝。16.根据权利要求13所述的方法，其中所述引物是通用引物、人工引物或肽核酸。17.根据权利要求13所述的方法，其中所述核酸扩增反应是聚合酶链反应(PCR)。18.根据权利要求13所述的方法，其中所述核酸扩增反应是等温扩增。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述等温扩增是环介导的等温扩增(LAMP)。20.根据权利要求18所述的方法，其中所述至少一种引物包括至少两种引物。21.根据权利要求1所述的方法，其中(b)包括测量电流变化，该变化指示所述靶核酸分子的存在。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述电流变化是电流相对于时间的一阶导数。23.根据权利要求1所述的方法，其中在促使所述样品流过所述至少一个纳米孔之后测量所述电流。24.根据权利要求1所述的方法，其中所述标签与所述靶核酸分子不可逆地偶联。25.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个纳米孔具有约0.5纳米(nm)至30nm的横截面尺寸。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述横截面尺寸为约2nm至15nm。27.根据权利要求1所述的方法，其中所述膜是固态膜。28.根据权利要求27所述的方法，其中所述固态膜包含半导体或非金属。29.根据权利要求27所述的方法，其中所述固态膜包含选自碳、硅、锗和砷化镓的材料。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述固态膜由石墨烯形成。31.根据权利要求1所述的方法，其中所述膜是脂双层。32.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个纳米孔是所述膜中的成孔蛋白质。33.根据权利要求32所述的方法，其中所述成孔蛋白质是α溶血素或MspA孔蛋白。34.根据权利要求1所述的方法，其中所述促使包括跨所述至少一个纳米孔施加电位。35.根据权利要求34所述的方法，其中所述电位是可逆的。36.根据权利要求34所述的方法，其中所述电位相对于参比为约1V至10V。37.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括跨所述至少一个纳米孔施加至少一个电位脉冲，以将所述靶核酸分子引导至和/或穿过所述至少一个纳米孔。38.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个纳米孔邻近或靠近附加电极。39.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸分子通过以下步骤进行检测：(i)在所述样品流过至少一个纳米孔时测量所述电流或其变化，以及(ii)将所述电流或其变化与参考值进行比较。40.根据权利要求1所述的方法，其中所述标签在所述标签与所述至少一个纳米孔相互作用后增加所述停留时间。41.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个纳米孔包括多个纳米孔。42.根据权利要求41所述的方法，其中所述多个纳米孔是可单独寻址的。43.根据权利要求1所述的方法，其中在所述样品流过所述至少一个纳米孔时，在没有获得所述靶核酸分子的核酸序列的情况下，根据所述电流或其变化的连续测量检测所述靶核酸分子。44.根据权利要求1所述的方法，其中在指示存在所述靶核酸分子的停留时间时检测所述电流或其变化。45.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸分...

【专利技术属性】
技术研发人员：李响，杨坤，
申请(专利权)人：卡尤迪生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11