一种基于常规凝胶电泳的核酸适配子诊断应用方法技术

一种基于常规凝胶电泳的核酸适配子诊断应用方法，属生物医学检测分析技术领域。本发明专利技术将核酸适配子与血清标本孵育，然后进行常规聚丙烯酰胺凝胶电泳和核酸染色，紫外灯下观察结果并采集紫外滤光图像，通过凝胶图像分析软件测定游离核酸适配子带的灰度值，定量分析病例与对照之间的差异，从而实现定量诊断。本发明专利技术以肝癌血清核酸适配子应用于肝癌诊断为研究模型，敏感度、特异度和准确度均高达90%以上。本发明专利技术方法简便易，实用价值大，诊断效率高，应用前景良好。

【技术实现步骤摘要】

本项专利技术属生物医学检测分析

技术介绍
核酸适配子(aptamer)是一种生物靶分子的人工单链寡核苷酸配体，通过SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)技术从随机单链寡核苷酸文库中筛选获得。核酸适配子筛选的基本步骤如下设计并合成随机单链寡核苷酸文库；将靶标与文库共孵育，使文库中能与靶标特异性结合的核酸与靶标形成复合物，分离后者并洗脱核酸，以洗脱的核酸作为模板进行体外扩增，制备成新的随机单链寡核苷酸文库，开始下一轮筛选；重复数轮筛选(孵育、分离、扩增)，与靶标高特异性和高亲和力结合的核酸序列将留在文库中并被指数富集；对最后一轮筛选后制备的文库进行克隆、测序，其中长度及两端固定序列与文库相符的寡核苷酸即为核酸适配子；测定各适配子与靶标结合的特异性和亲和力，选择能高特异性和高亲和力结合靶标的核酸适配子应用于靶标的检测分析。核酸适配子筛选过程中所用文库中的寡核苷酸序列两端为固定序列，中间为随机序列。固定序列为PCR引物提供结合部位，便于SELEX筛选过程中进行PCR扩增，以制备下一轮筛选的文库。随机序列使文库中核酸序列的多样性极为丰富，当随机区长度为25个核苷酸时，文库的多样性理论上能达到1015 ( 425=1. 12615)。单链寡核苷酸的一个独特表现是容易形成各种形状的二级结构和三级结构，如发夹、口袋、假结、凸环、G-四聚体(G-quartet) 等。通过分子构象间的“锁钥”匹配，核酸适配子与靶分子相互适配，加上氢键、范德华力等的作用，两者形成稳定的复合物。IO15的文库多样性所拥有的丰富的寡核苷酸分子构象可为自然界存在的几乎所有种类的分子找到能“锁钥”匹配的核酸序列(核酸适配子)。目前， 通过SELEX技术已筛选出各种不同类型靶分子的核酸适配子，包括与基因调控有关的核酸结合蛋白(如噬菌体T4 DNA聚合酶、HIV-I Rev蛋白、核糖体蛋白Sl)，非核酸结合蛋白(如凝血酶、各种细胞因子、辅因子、缓激肽、IgE抗体)，小分子有机物(如ATP、茶碱、氨基酸、维生素)，甚至金属离子、多糖、有机染料，以及完整的细胞、病毒、孢子等。核酸适配子的功能与抗体类似，但与抗体相比具有许多优点①高特异性和高亲性核酸适配子能够分辨出靶分子结构上细微的差别，亲和力甚至强于天然配体；②靶标广泛从有机小分子、生物大分子到病毒颗粒、完整细胞等均可作为筛选核酸适配子的靶标；③稳定性好核酸适配子可长期保存，通过人工合成而无批间差异，可在常温下运输； ④改建和修饰容易可在核酸适配子的特定部位进行精确的标记、修饰或核苷酸替换；⑤ 应用优势核酸适配子无免疫原性，可在体内反复使用；分子小，方便于体内影像诊断和治疗。核酸适配子在人类疾病的诊断方面显示出良好的应用前景。Golden等用核酸适配子检测碱性成纤维生长因子(bFGF)，其敏感性高于商业化ELISA试剂盒近20倍，且特异性良好。Liu等用核酸适配子纳米传感器可以快速、敏感、特异地检出循环血液中的肿瘤细3胞。McCauley等研制出核酸适配子传感器阵列，能特异且定量检测出与血清或细胞提取物混合的3种肿瘤标志物。Hicke等用放射性核素标记黏韧素-C的核酸适配子，成功应用于人胶质母细胞瘤和乳腺癌动物模型的肿瘤显像。目前核酸适配子应用于靶标检测的方法有流式细胞术、生物芯片技术、双位点结合试验(夹心法)、分子信标、生物传感器等，但这些方法或需要昂贵的仪器设备，或对核酸适配子有特殊要求，或需要复杂的实验技术，实用价值差，以致迄今为止，尚无真正意义上的核酸适配子临床诊断应用。建立具有临床实用价值且简便易行的核酸适配子诊断应用新技术具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是创建一种简便易行的核酸适配子检测应用技术，为相应靶标的分析提供一种具有实用价值的方法，便于临床诊断应用。本专利技术采用的技术方案先分别确定核酸适配子的合适用量和液态标本的合适用量，再将合适用量的核酸适配子与合适用量的待测标本进行孵育，然后直接进行凝胶电泳、 核酸染色和灰度测定，对灰度测定指标进行统计学分析，确定阳性与阴性的判别界值，评估核酸适配子的临床诊断效率。本专利技术的方法包括以下步骤。a.核酸适配子用量确定由于核酸适配子的核苷酸序列不同，相同摩尔量的不同核酸适配子在凝胶电泳中的条带强弱可以不同。因此，在将核酸适配子应用于标本检测之前，应确定其合适的用量，方法如下以最低量为2pmol的等差梯度量的核酸适配子溶液进行常规凝胶电泳和核酸染色，紫外灯下观察核酸适配子带的亮度，采集图像并使用凝胶分析软件测定条带的灰度值，以核酸适配子带灰度值保持在线性范围内的最大摩尔量确定为核酸适配子用量。b.标本用量确定核酸适配子与标本的反应物在凝胶电泳中可表现为结合带和游离带，游离带的强弱与标本用量有关，在进行核酸适配子的标本检测之前，应确定合适的标本用量，方法如下将步骤a确定的核酸适配子用量与最低量为2μ 1的等差梯度体积的所要诊断疾病的混合体液标本混勻后孵育，然后进行常规凝胶电泳和核酸染色，紫外灯下观察游离核酸适配子带的亮度，采集图像并使用凝胶分析软件测定游离核酸适配子带的灰度值，以核酸适配子带灰度值保持在线性范围内的最小灰度值者所对应的标本体积确定为标本用量。c.标本检测及数据采集收集患有所要诊断疾病(如肝癌)的患者的体液标本归为病例组和不患有所要诊断疾病(如各种非肝癌)的患者的体液标本归为对照组，以步骤a 确定核酸适配子用量和步骤b确定的标本用量为条件，将核酸适配子分别与病例组和对照组的各标本混勻后孵育，然后进行常规凝胶电泳和核酸染色，紫外灯下观察游离核酸适配子带的亮度，采集图像并使用凝胶分析软件测定各标本的游离核酸适配子带的灰度值。同时每块凝胶均以结合缓冲液代替标本做一孔适配子对照。d.诊断价值评估获取凝胶分析软件测定的核酸适配子游离带的灰度相关指标 (灰度值、灰度构成比、框选面积、平均灰度值及其标准差、平均密度)，并计算各标本与同块凝胶的适配子对照的灰度比值。对灰度比值进行受试者工作特征(ROC)曲线分析，获得其ROC曲线下面积(AUC)和最佳诊断界值，并计算其诊断病例组标本的敏感度、特异度和准确度；对灰度相关指标进行多因素Logistic回归分析，并以Logistic回归方程的概率预测值为指标进行ROC曲线分析，获得多指标联合检测的AUC和最佳诊断界值，并计算其诊断病例组标本的敏感度、特异度和准确度。其中上述步骤中所述的核酸适配子为通过SELEX技术筛选出来的具有特异性识别靶标的特定单链核酸序列(ssDNA或RNA)。其中上述步骤中所述的常规凝胶电泳是指以常用凝胶为介质的低压电分离技术， 包括聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶。其中上述步骤中所述的核酸染色为使用核酸染料对凝胶中的核酸适配子进行染色，优选使用GelRed染料。其中上述步骤中所述的紫外灯下观察实验结果和图像采集，是通过紫外透射仪观察，并借助其紫外滤光照相附件和数码相机拍摄图像完成，或通过凝胶电泳成像分析系统完成结果观察和图像采集。其中上述步骤中所述的体液标本是指各种液态生物标本，如血清、血浆、体腔积液、尿液、细胞培养液及组织细胞裂解液等；混合体液标本是指用一组性质相同但背景各异本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张焜和，徐国峰，魏淑琴，陈文学，王婷，曾琴，吕农华，张吉翔，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：