一种删除转基因大豆筛选标记的方法技术

本发明专利技术涉及转基因植物，具体公开了一种删除转基因大豆筛选标记的方法，将含有筛选标记的转基因大豆种子在含有β‑雌二醇的育苗基质中播种培养，在大豆种子萌发出苗阶段和大豆幼苗生长期间进行β‑雌二醇处理诱导，待幼苗生长至21～42d时，筛选获得能够表达目的基因、且无筛选标记的转基因大豆植株，正常管理直到结荚成熟，收获无筛选标记的转基因大豆种子。利用本发明专利技术提供的方法可以显著提高转基因大豆标记基因的删除率(达到50％以上)。培养的大豆幼苗生长健壮，有效提高了转基因大豆的成活率(达到97％以上)，大豆生长发育良好，结实率高，可以获得大量的无标记基因的转基因大豆，对推动转基大豆因商业化有重要的理论及实践意义。

【技术实现步骤摘要】
一种删除转基因大豆筛选标记的方法
本专利技术涉及转基因植物，具体地说，涉及一种删除转基因大豆筛选标记的方法。
技术介绍
大豆原产中国，是世界上重要油料作物之一。大豆是最早开展转基因研究的作物之一。据报道通过转基因技术已成功转入了抗旱、抗除草剂、抗病虫、耐盐碱等基因，为培育具有优良性状的转基因大豆新品种提供了基础。但由于转基因植物的安全性等问题限制了转基因大豆的推广应用。目前，转基因技术可能存在的潜在安全风险问题受到公众的广泛关注，而转基因技术中标记基因的安全性问题已成为当今基因工程研究的热点。选择标记基因是目前阻碍转基因植物发展的因素之一。选择标记基因编码一种正常植物细胞不存在的酶，能在转化体中有效表达并易于检测或定量分析。其功能是在某种选择压力下，将转化体筛选出来。常用的选择标记基因包括抗生素基因和除草剂基因。抗生素基因主要包括nptⅡ、cat、spt等；除草剂抗性基因有抗草丁膦和双丙膦的bar和pat及抗草甘膦的epsps基因等。这些选择标记基因虽然方便、廉价，但是，当获得转基因植株后，筛选标记基因就失去价值，其继续表达的产物也会带来安全隐患，从而引起人们转基因植物安全问题的担忧，极大地阻碍了转基因作物商业化的发展。国内外大量的学者认为删除选择标记基因是必要的。综合以上情况，消除选择标记，培育无选择标记的转基因植物，对推动转基因作物的商业化发展意义重大。当前用于剔除筛选标记基因的方法有共转化法(co-transformation)、位点特异性重组法(site-specificrecombination)、转座子法(transposon)、染色体同源重组法(intra-chromosomalrecombination)。例如张秀春(2006)利用双T-DNA载体、叶兴国(2007)利用三T-DNA载体转化方法获得无筛选标记转基因大豆，标记基因删除效率分别为5.6％和7.6％。目前位点特异性重组是删除选择标记基因的一种有效途径，已经广泛应用于不同植物的转基因体系中。其中来自噬菌体P1的Cre/LoxP系统在所有位点特异性重组系统中应用的最广、最完善、具有较高可控性的转化系统。其原理如下：Cre/loxP位点特异性重组系统中的Cre重组酶专一性地识别由34个碱基对组成的特异序列(loxP位点)，使2个loxP位点片段发生重组，2个loxP位点之间的基因或DNA序列从而被剔除。李茂福等(2016)构建载体的Cre受热激启动子调控，对转基因植株进行37℃热激处理3d获得无选择标记转基因苹果植株(李茂福等，loxp系统的构建及无选择标记转基因苹果植株的获得[J].园艺学报，2016，(02):205-217.)。Zuo等(2000)构建了一种化学诱导与特异性位点重组相结合的高效DNA切除载体PX6-GFP，在PX6-GFP载体中，cre基因的表达受“雌激素受体反式激活因子”XVE的严格控制，而XVE受β-雌二醇诱导。PX6-GFP将“loxP-XVE-nptII(标记基因)-Cre-loxP”三个串联的转录单元位构建于2个loxP位点之间。因此，当用β-雌二醇诱导XVE表达后，cre被XVE激活，Loxp序列之间的3个转录单元被剔除。Zuo等在转基因操作的拟南芥芽诱导的培养基中添加β-雌二醇(2μmol/L)，诱导cre酶表达，删除了标记基因(ZuoJ，NiuQW，MollerSG，etal.Chemical-regulated，site-specificDNAexcisionintransgenicplants.[J].NatureBiotechnology，2001，19(2):157-161.)。众多转基因研究工作者在此载体基础上加以改造，在PX6-GFP载体上插入目的基因转化植物，利用PX6-GFP的删除原理获得无筛选标记的转基因植物。赵艳(2011)等利用Cre/LoxP系统删除水稻，在抗性愈伤组织培养的预分化前、预分化和分化阶段添加雌激素EST(5μmol/L)诱导表达重组酶Cre均能成功切除标记基因序列，标记基因剪切成功率为6.82％～46.64％。马连杰等(2011)对获得的含抗性标记基因的马铃薯植株茎段进行再次的组织培养，经过愈伤诱导和芽分化阶段添加3μmol/L(β-雌二醇)删除诱导剂，获得无筛选标记的马铃薯，标记基因删除成功率为8.8％。在公开的Cre/LoxP系统删除的技术中，薛静等专利技术的“删除转基因植物中抗生素标记基因的系统及其应用”(CN102337292A)利用分别含有LoxP位点和Cre的两个载体获得的转基因植株进行杂交，在后代中获得删除抗生素标记基因的植株。贾桂霞专利技术的：“一种删除选择标记基因的百合转基因方法”(CN102559741A)，将转基因的百合小鳞茎转入分化培养基，通过4℃低温诱导12h将标记基因删除。诸葛强等专利技术的“一种删除转基因杨树选择标记基因的方法”(CN102181476A)利用培养基中添加β-雌二醇，诱导转基因植株茎段形成愈伤至植株再生过程删除选择标记基因。以上技术均是在转基因组培苗再生阶段进行β-雌二醇诱导。目前应用Cre/LoxP系统进行大豆筛选标记删除技术的报道有：芦晓晶(2007)利用Cre/LoxP系统删除大豆转基因苗中的筛选标记基因，具体方法是当大豆转化不定芽伸长到约1厘米左右时转移到含β-雌二醇(5μmol/L)的诱导培养基上，培养半个月后检测到选择性标记被剔除的转化芽，但是β—雌二醇对转化芽有抑制作用，幼苗长势皆不佳，而且都具白化趋势，最终未获得成熟大豆转化植株。综上所述，每种植物乃至不同器官对“PX6-基因”的删除系统中的删除剂β-雌二醇的敏感性不同。尤其是大豆本身遗传转化效率就低，在转基因操作的芽诱导的培养基添加β-雌二醇来删除标记基因(芦晓晶，无选择标记植物表达载体的构建及转基因大豆的获得[D].东北师范大学，2007)，使大豆转化不定芽受到删除剂的严重抑制，生长缓慢，获得的幼苗弱，甚至不能获得有效大豆转化植株及后代。由此可见，删除剂的使用浓度、处理时间和操作方式是影响获得无筛选标记转基因大豆的三个关键因素。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种删除转基因大豆筛选标记的方法，通过优化筛选剂的使用浓度、处理时间以及对转基因大豆的处理方式提高删除转基因大豆筛选标记的有效率和转基因大豆的成活率。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：一种删除转基因大豆筛选标记的方法，将含有筛选标记的转基因大豆种子(利用含Cre/loxP位点特异性重组系统载体“px6-目的基因载体”获得的转基因大豆种子)在含有β-雌二醇的育苗基质中播种培养，记为0d，在大豆种子萌发出苗阶段和大豆幼苗生长期间进行β-雌二醇处理诱导，待幼苗生长至21～42d时，筛选能够表达目的基因、且无筛选标记的转基因大豆植株，正常管理直到结荚成熟，收获无筛选标记的转基因大豆种子。所述标记基因通过含Cre/loxP位点特异性重组系统载体，伴随目的基因一同转入大豆中，所述标记基因位于两个loxP位点之间。所述标记基因包括但不限于新霉素磷酸转移酶Ⅱ基因(nptⅡ)、潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)、草丁膦N－乙酰转移酶基因(bar)等。进一步地，在大豆种子萌发出本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种删除转基因大豆筛选标记的方法，其特征在于，将含有筛选标记的转基因大豆种子在含有β‑雌二醇的育苗基质中播种培养，在大豆种子萌发出苗阶段和大豆幼苗生长期间进行β‑雌二醇处理诱导，待幼苗生长至21～42d时，筛选获得能够表达目的基因、且无筛选标记的转基因大豆植株，正常管理直到结荚成熟，收获无筛选标记的转基因大豆种子。

【技术特征摘要】
1.一种删除转基因大豆筛选标记的方法，其特征在于，将含有筛选标记的转基因大豆种子在含有β-雌二醇的育苗基质中播种培养，在大豆种子萌发出苗阶段和大豆幼苗生长期间进行β-雌二醇处理诱导，待幼苗生长至21～42d时，筛选获得能够表达目的基因、且无筛选标记的转基因大豆植株，正常管理直到结荚成熟，收获无筛选标记的转基因大豆种子。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在大豆种子萌发出苗阶段向育苗基质浇灌含有6～14μmol/Lβ-雌二醇的水溶液；在大豆幼苗生长期间向育苗基质浇灌6～14μmol/Lβ-雌二醇霍格兰氏全营养液。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，根据育苗基质的干湿程度浇灌，以保证大豆苗正常生长所需要的水分和营养。4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述标记基因通过含Cre/loxP位点特异性重组系统载体，进入转基因大豆中，所述标记基因位于两个loxP位点之间。5.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述含有β-雌二醇的水溶液和β-雌二醇霍格兰氏全营养液中β-雌二醇的浓度为8～12μmol/L。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述含有β-雌二醇的水溶液和β-雌二醇霍格兰氏全营养液中β-雌二醇的浓度为10μmol/L。7.根据权利要求1～3任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：李桂兰，乔潇，董秋平，乔亚科，张锴，
申请(专利权)人：河北科技师范学院，
类型：发明
国别省市：河北,13