提高大豆转化效率的方法技术
【技术实现步骤摘要】
提高大豆转化效率的方法
本专利技术涉及一种植物转化的方法，特别是涉及一种通过外施筛选剂以提高大豆转化效率的方法。
技术介绍
随着转基因植物种类和种植面积的迅猛增加，转基因植物中选择标记基因的生物安全性已成为人们普遍关注的问题之一。合适的标记基因可以为获得真正的转化体提供有力的判断依据，在植物遗传转化过程中发挥着至关重要的作用。目前在植物遗传转化中广泛应用的标记基因有抗生素抗性基因(如NPTⅡ基因、HPT基因等)和除草剂抗性基因(如PAT基因、EPSPS基因、bar基因等)，由于选择标记基因一旦转化成功便不再有用，甚至对生态环境和食品安全存在潜在威胁，所以对生物安全性标记基因的开发显得非常重要。乙酰乳酸合成酶(AcetolactateSynthase，以下称为“ALS”)存在于植物生长过程中，它能以高度专一性和极高的催化效率催化丙酮酸为乙酰乳酸，从而导致支链氨基酸的生物合成。亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸是植物体内3种必需的支链氨基酸，而ALS不仅是催化亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸生物合成过程中的关键酶，其活性也受产物缬氨酸和异亮氨酸的反馈调节。ALS抑制剂是一类已知的除草剂...
【技术保护点】
一种选择转化的植物细胞的方法，其特征在于，包括：使用含有目标基因和编码磺酰脲类除草剂水解酶的基因的重组载体，转化植物细胞；通过外施ALS抑制剂对上述转化后的植物细胞进行筛选培养，以编码磺酰脲类除草剂水解酶的基因作为选择标记物；选择未被杀死和/或未被抑制的植物细胞。
【技术特征摘要】
1.一种选择转化的植物细胞的方法，其特征在于，包括：使用含有目标基因和编码磺酰脲类除草剂水解酶的基因的重组载体，转化植物细胞；通过外施ALS抑制剂对上述转化后的植物细胞进行筛选培养，以编码磺酰脲类除草剂水解酶的基因作为选择标记物；选择未被杀死和/或未被抑制的植物细胞。2.根据权利要求1所述选择转化的植物细胞的方法，其特征在于，所述转化植物细胞为通过农杆菌介导过程转化植物细胞。3.根据权利要求1或2所述选择转化的植物细胞的方法，其特征在于，所述植物细胞为大豆细胞。4.根据权利要求1-3任一项所述选择转化的植物细胞的方法，其特征在于，所述外施包括滴加、喷施或涂抹。5.根据权利要求1-4任一项所述选择转化的植物细胞的方法，其特征在于，所述ALS抑制剂包括磺酰脲类化合物、咪唑啉酮类化合物、三唑并嘧啶类化合物、嘧啶基硫代苯甲酸类化合物或磺酰氨基-羰基-三唑啉酮类化合物。6.根据权利要求5所述选择转化的植物细胞的方法，其特征在于，所述磺酰脲类化合物为苯磺隆、甲嘧磺隆、吡嘧磺隆、氯吡嘧磺隆、噻吩磺隆、苄嘧磺隆、甲磺隆、胺苯磺隆或氯嘧磺隆。7.根据权利要求6所述选择转化的植物细胞的方法，其特征在于，所述磺酰脲类化合物为苯磺隆时，每毫升增殖培养基外施苯磺隆1-7μg。8.根据权利要求7所述选择转化的植物细胞的方法，其特征在于，所述磺酰脲类化合物为苯磺隆时，每毫升增殖培养基外施苯磺隆3μg。9.根据权利要求6-8任一项所述选择转化的植物细胞的方法，其特征在于，外施苯磺隆前在增殖培养基中培养5-9天。10.根据权利要求9所述选择转化的植物细胞的方法，其特征在于，外施苯磺隆前在增殖培养基中培养7天。11.根据权利要求1-10任一项所述选择转化的植物细胞的方法，其特征在于，所述磺酰脲类除草剂水解酶包含：(a)具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有芳氧基链烷酸酯双加氧酶活性的由(a)衍生的蛋白质；或(c)与SEQIDNO:2具有至少90％序列同一性的氨基酸序列组成的蛋白质。12.一种由农杆菌介导且以编码磺酰脲类除草剂水解酶的基因作为选择标记物来制备转基因植物的方法，其中，包括：制备至少包括能被农杆菌菌株转化的植物细胞的外植体；将至少包括所述外植体中所述植物细胞的区域接触至少包含编码磺酰脲类除草剂水解酶的基因的农杆菌菌株；通过外施ALS抑制剂对所述外植体进行筛选培养；选择未被杀死和/或未被抑制的转化植物细胞；所述转化植物细胞再生成植物。13.根据权利要求11所述由农杆菌介导且以编码磺酰脲类除草剂水解酶的基因作为选择标记物来制备转基因植物的方法，其特征在于，所述植物细胞为大豆细胞。14.根据权利要求13所述由农杆菌介导且以编码磺酰脲类除草剂水解酶的基因作为选择标记物来制备转基因植物的方法，其特征在于，所述外植体为有子叶的外植体、半粒种子外植体或半胚胎种子外植体。15.根据权利要求12-14任一项所述由农杆菌介导且以编码磺酰脲类除草剂水解酶的基因作为选择标记物来制备转基因植物的方法，其特征在于，所述外施包括滴加、喷施或涂抹。16.根据权利要求12-15任一项所述由农杆菌介导且以编码磺酰脲类除草剂水解酶的基因作为选择标记物来制备转基因植物的方法，其特征在于，所述ALS抑制剂包括磺酰脲类化合物、咪唑啉酮类化合物、三唑并嘧啶类化合物、嘧啶基硫代苯甲酸类化合物或磺酰氨基-羰基-三唑啉酮类化合物。17.根据权利要求16所述由农杆菌介导且以编码磺酰脲类除草剂水解酶的基因作为选择标记物来制备转基因植物的方法，其特征在于，所述磺酰脲类化合物为苯磺隆、甲嘧磺隆、吡嘧磺隆、氯吡嘧磺隆、噻吩磺隆、苄嘧磺隆、甲磺隆、胺苯磺隆或氯嘧磺隆。18.根据权利要求17所述由农杆菌介导且以编码磺酰脲类除草剂水解酶的基因作为选择标记物来制备转基因植物的方法，其特征在于，所述磺酰脲类化合物为苯磺隆时，每毫升增殖培养基外施苯磺隆1-7μg。19.根据权利要求18所述由农杆菌介导且以编码磺酰脲类除草剂水解酶的基因作为选择标记物来制备转基因植物的方法，其特征在于，所述磺酰脲类化合物为苯磺隆时，每毫升增殖培养基外施苯磺隆3μg。20.根据权利要求17-19所述由农杆菌介导且以编码磺酰脲类除草剂水解酶的基因作为选择标记物来制备转基因植物的方法，其特征在于，外施苯磺隆前在增殖培养基中培养5-9天。21.根据权利要求20所述由农杆菌介导且以编码磺酰脲类除草剂水解酶的基因作为选择标记物来制备转基因植物的方法，其特征在于，外施苯磺隆前在增殖培养基中培养7天。22.根据权利要求12-21任一项所述由农杆菌介导且以编码磺酰脲类除草剂水解酶的基因作为选择标记物来制备转基因植物的方法，其特征在于，所述转化植物细胞再生成植物具体为通过外施ALS抑制剂使得所述转化植物细胞在分化培养基中培养分化成植物。23.根据权利要求22所述由农杆菌介导且以编码磺酰脲类除草剂水解酶的基因作为选择标记物来制备转基因植物的方法，其特征在于，所述ALS抑制剂为苯磺隆时，每毫升分化培养基外施苯磺隆3-7μg。24.根据权利要求23所述由农杆菌介导且以编码磺酰脲类除草剂水解酶的基因作为选择标记物来制备转基因植物的方法，其特征在于，所述ALS抑制剂为苯磺隆时，每毫升分化培养基外施苯磺隆7μg。25.根据权利要求22-24任一项所述由农杆菌介导且以编码磺酰脲类除草剂水解酶的基因作为选择标记物来制备转基因植物的方法，其特征在于，外施苯磺隆前在分化培养基中培养14-20天。26.根据权利要求25所述由农杆菌介导且以编码磺酰脲类除草剂水解酶的基因作为选择标记物来制备转基因植物的方法，其特征在于，外施苯磺隆前在分化培养基中培养18天。27.根据权利要求12-26任一项所述由农杆菌介导且以编码磺酰脲类除草剂水解酶的基因作为选择标记物来制备转基因植物的方法，其特征在于，所述农杆菌菌株还包括赋予除草剂耐受性的基因和/或昆虫抗性的基因。28.根据权利要求27所述由农杆菌介导且以编码磺酰脲类除草剂水解酶的基因作为选择标记物来制备转基因植物的方法，其特征在于，所述赋予除草剂耐受性的基因编码如下除草剂耐受性蛋白质：5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、草甘膦氧化还原酶、草甘膦-N-乙酰转移酶、草甘膦脱羧酶、草铵膦乙酰转移酶、α酮戊二酸依赖性双加氧酶、麦草畏单加氧酶、4-羟苯基丙酮酸双加氧酶、乙酰乳酸合酶、细胞色素类蛋白质和/或原卟啉原氧化酶。29.根据权利要求27或28所述由农杆菌介导且以编码磺酰脲类除草剂水解酶的基因作为选择标记物来制备转基因植物的方法，其特征在于，所述昆虫抗性的基因包括Cry类基因或Vip类基因。30.根据权利要求12-29任一项所述由农杆菌介导且以编码磺酰脲类除草剂水解酶的基因作为选择标记物来制备转基因植物的方法，其特征在于，所述磺酰脲类除草剂水解酶包含：(a)具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有芳氧基链烷酸酯双加氧酶活性的由(a)衍生的蛋白质；或(c)与SEQIDNO:2具有至少90％序列同一性的氨基酸序列组成的蛋白质。31.一种转化大豆的方法，其中，包括：大豆种子萌发后去除一片子叶和第一片真叶，获...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘雁华，王媛媛，贾志伟，宋庆芳，
申请(专利权)人：北京大北农生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11
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