用于植物基因表达载体构建的质粒载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于植物基因表达载体构建的质粒载体及其应用。利用经大肠杆菌质粒pUC18改造的pKAFCR1和经双核农杆菌Ti质粒pBI121改造的pKAFCR100两种质粒，在pKAFCR1的35S启动子和NOS终止子之间引入多个克隆酶切位点MCS，然后将包含35S‑MCS‑NOS片段切下连接到pKAFCR100，从而构建成质粒载体pNULPGE200。经PCR等方法克隆得到的目的基因可以多种方式很方便地连接到该质粒载体的35S启动子与NOS终止子之间的多个克隆酶切位点MCS，使目的基因能够在植物体内稳定表达；该质粒载体还具有独立表达的卡那霉素NPT II耐性基因和sGFP绿色荧光蛋白报告基因，能够显著提高转基因植物细胞的选拔效果。

【技术实现步骤摘要】
用于植物基因表达载体构建的质粒载体及其应用
本专利技术涉及植物基因领域，具体涉及一种用于植物基因表达载体构建的质粒载体及其应用。
技术介绍
植物基因工程技术的迅速发展和广泛应用为植物的遗传改良开拓了广阔的前景。该技术克服了植物有性杂交的限制，可将来源于不同物种甚至人工合成的基因导入植物，从而改良植物性状，培育优质高产作物新品种。在植物基因克隆、基因功能分析以及基因转化等分子生物学的研究与应用过程中，需要构建植物基因表达载体。但是，目前常用于植物基因表达载体构建的质粒，如pBIN19(Bevan，1984)、pBI121(Jefferson，1987)、pIG121-Hm(Ohtaetal.，1999)、pMSIsGFP(Kawasakietal.，1999)等，由于其T-DNA领域中限制性内切酶位点有限，目的基因难于插入和连接，而且目的基因在植物体内表达还需要启动子、终止子、筛选标记等功能元件，需要构建多个中间载体，操作比较麻烦。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种用于植物基因表达载体构建的质粒载体pNULPGE200及其应用方法。经PCR等方法克隆得到的目的基因可以多种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于植物基因表达载体构建的质粒载体pNULPGE200，其特征在于，经PCR克隆得到的目的基因可方便地连接到pNULPGE200的35S启动子与NOS终止子之间的多个克隆酶切位点MCS，使目的基因能够在植物体内稳定表达；同时该质粒载体还具有独立表达的卡那霉素NPT II耐性基因和sGFP绿色荧光蛋白报告基因，能够显著提高转基因植物细胞的选拔效果；所述质粒载体pNULPGE200的构建，包括如下步骤：S1、在pKAFCR1质粒的35S启动子和NOS终止子之间引入多克隆酶切位点MCSS11、利用限制性内切酶Xba I和Sac I，对pKAFCR1质粒进行双酶切处理，切除其原有的Xba I到Sa...

【技术特征摘要】
1.一种用于植物基因表达载体构建的质粒载体pNULPGE200，其特征在于，经PCR克隆得到的目的基因可方便地连接到pNULPGE200的35S启动子与NOS终止子之间的多个克隆酶切位点MCS，使目的基因能够在植物体内稳定表达；同时该质粒载体还具有独立表达的卡那霉素NPTII耐性基因和sGFP绿色荧光蛋白报告基因，能够显著提高转基因植物细胞的选拔效果；所述质粒载体pNULPGE200的构建，包括如下步骤：S1、在pKAFCR1质粒的35S启动子和NOS终止子之间引入多克隆酶切位点MCSS11、利用限制性内切酶XbaI和SacI，对pKAFCR1质粒进行双酶切处理，切除其原有的XbaI到SacI部分；S12、将双酶切后的pKAFCR1经1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，切取目的条带，通过常规的凝胶回收方法或凝胶回收试剂盒获得已切除XbaI和SacI部分的pKAFCR1；S13、人工合成以下两条单链DNA：CR1MCSin-S：5’-CTAGAGTTAACTTAATTAACCCGGGAGGCCTGGTACCCTCGAGGAGCT-3’；CR1MCSin-A：5’-CCTCGAGGGTACCAGGCCTCCCGGGTTAATTAAGTTAACT-3’；然后采用温度梯度退火法，使两条单链DNA构成一条双链DNA片段，该片段含有XbaI、HpaI、PacI、XmaI(SmaI)、StuI、KpnI、XhoI和Sac/等多个克隆酶切位点MCS；反应条件为94℃3sec，95℃5min，95℃至25℃温度梯度0.1℃/sec，25℃15min；S14、利用T4-DNA连接酶或质粒连接用试剂盒将已切除XbaI和SacI部分...

【专利技术属性】
技术研发人员：安韶雅，虎娟，周涛，林哲，张虹，陈任，
申请(专利权)人：宁夏大学，
类型：发明
国别省市：宁夏,64