The invention relates to a cultivation method for cancer treatment of T cells, in order to solve the existing technology can not get a number of in vitro T cells, which comprises the following steps: 1) separation of mononuclear cells: 2) mononuclear cell washing: 3) mononuclear cell culture: according to the total number of cells measured before joining steps. With BK AEC IL2 lymphocytes cultured in serum-free medium, resuspended CD3 monoclonal antibody; good ventilation cover cell culture protection liquid suction bottle, and then transfer the cell suspension to coated cell culture bottle, sealed, placed in an incubator at 37 C, cultured for 5% CO2; 4 Day) 1 14 amplification: T cell amplification in T cells: the late late stage expansion when incubated with cell culture bag culture, finally expanded to 1 3 x 10
【技术实现步骤摘要】
用于肿瘤治疗的T细胞培养方法
本专利技术涉及一种细胞培养方法，特别是涉及一种用于肿瘤治疗的T细胞培养方法。
技术介绍
癌症是目前困扰人类的最为重大的疾病之一，无论发病率还是死亡率均呈持续上升趋势。我国具有13.7亿的庞大人口，据统计显示，2015年我国约有4292,000例癌症新发病例，其中2814,000例死亡，癌症治疗问题亟待解决；肿瘤临床治疗基本以手术、放疗和化疗为主，但手术和放疗虽然在控制肿瘤的局部病灶方面有很好的疗效，但在预防肿瘤的复发和转移方面显得无能为力，而肿瘤的免疫学治疗可以弥补传统治疗手段的这一不足，给癌症治疗带来新的曙光。肿瘤免疫学治疗是通过激发或调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而达到控制和杀死癌细胞的目的。目前，肿瘤免疫学治疗已成为继手术治疗，放、化疗之后的第四种癌症治疗模式，正逐渐为人们所接受。这些方法可以清除、杀死少量的术后残留或扩散的癌细胞，提高、巩固癌症治疗的效果，减少癌症的复发。T细胞由多能造血干细胞发育分化而来。体内存在能特异性识别各种抗原的T细胞库。淋巴样前体细胞进入胸腺之初尚未表达T细胞表面标志，但表达末端脱...
【技术保护点】
一种用于肿瘤治疗的T细胞培养方法，其特征在于包括下列步骤：1）分离单核细胞：在原血中加入等体积的生理盐水，吹打均匀；根据血液体积计算需要的离心管的个数，离心管中分别加入FicoLL；用移液管把稀释后的血样缓缓加入到盛有FicoLL的离心管中，旋紧盖子，离心；注意血液要加到淋巴分离液的上层，切勿打破分界面；将上述离心好的样品轻轻取出离心机放入生物安全柜，在光照下可以看到样品在离心管里大致分成四层，从上到下依次为生理盐水血浆层、单核细胞层、FicoLL层、粒细胞红细胞层；用移液管小心将血浆层尽量吸弃干净，然后沿离心管壁小心将单核细胞层吸取转移到若干离心管中，等体积添加生理盐水，...
【技术特征摘要】
1.一种用于肿瘤治疗的T细胞培养方法，其特征在于包括下列步骤：1）分离单核细胞：在原血中加入等体积的生理盐水，吹打均匀；根据血液体积计算需要的离心管的个数，离心管中分别加入FicoLL；用移液管把稀释后的血样缓缓加入到盛有FicoLL的离心管中，旋紧盖子，离心；注意血液要加到淋巴分离液的上层，切勿打破分界面；将上述离心好的样品轻轻取出离心机放入生物安全柜，在光照下可以看到样品在离心管里大致分成四层，从上到下依次为生理盐水血浆层、单核细胞层、FicoLL层、粒细胞红细胞层；用移液管小心将血浆层尽量吸弃干净，然后沿离心管壁小心将单核细胞层吸取转移到若干离心管中，等体积添加生理盐水，旋紧盖子颠倒混匀；2）单核细胞洗涤：将上述收集好的细胞稀释液进行离心，弃上清；用生理盐水定容，混合均匀，离心；重复洗涤细胞1次，离心前吸取样本，赤藓红染色计数；最后收集得到的沉淀即为单核细胞；3）单核细胞培养：根据前步骤中测得的细胞总数，加入含BK-AEC-IL2的淋巴细胞无血清培养基，重悬；将CD3单抗包被好的透气盖细胞培养瓶中的保护液吸出，再将细胞悬液转移到包被过的细胞培养瓶中，旋紧瓶盖，置于培养箱中37℃，5%CO2培养；4）Day1-14扩增：T细胞前期扩增：细胞接种前三天无需镜下观察细胞状态；三天后，须每日镜下观察细胞状态，观察的指标包括：细胞形态变化、数量变化、培养基颜色变化；一般情况下此时细胞体积明显增大，形状多呈增殖分裂状，细胞集落出现、细胞数量增多、培养基颜色变为黄色，因为随着细胞数量的增多，其代谢产物也会增多，会导致培养体系PH的变化而引起培养基颜色改变，这种情况下，要给培养体系加入新鲜的已加入因子的无血清培养基以满足细胞生长的需要；T细胞后期扩增：在T细胞后期扩大培养时用细胞培养袋培养，最后扩增到1-3×109以上即可；Day12无菌检测：细胞收获前两天，要对培养体系做无菌检测；将细胞培养袋放入生物安全柜中，挤压袋子，混匀体系，打开培养袋取样管盖子，用注射器抽取细胞样本，做微生物检测；5）Day14收获：（1）从培养箱中取出细胞培养袋，置于生物安全柜中，将细胞悬液从细胞培养袋中转入若干离心管中，拧紧盖子，配平后置于离心机中，离心，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块；（2）用已加入适量人血白蛋白生理盐水洗离心管多次，细胞悬液并入另一离心管中；依此操作，将离心管并为两个，离心，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块；（3）用已加入适量人血白蛋白生理盐水洗离心管多次，合并细胞悬液，吸取细胞样本于离心管中，交予质量人员进行细胞计数，用生理盐水将细胞悬液定容，离心，弃上清，用涡旋振荡器振散细胞团块；（4）加入生理盐水混匀细胞，加入适量人血白蛋白；取出细胞样品，交给质量部进行内毒素及微生物检测，并留样冻于-80℃冰箱待后续检测，细胞悬液过细胞筛后，通过注射器将细胞悬液转入细胞转移袋中，用封管热合器封口，待出厂细胞检测合格即为成品。2.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于所述细胞检验有：细胞数量与活性检测、细胞无菌检测、支原体检测、内毒素检测、细胞表型检测。3.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于细胞数量与活性检测是：将细胞样本混匀，取10μL细胞悬液用10μL赤藓红染色，经血球计数板进行多次计数，根据平均值算出细胞的数量与活性，细胞数量要求1-3×109,细胞活性要求≧90%；细胞无菌检测是：将细胞样本混匀，取适量分别接种到硫乙醇酸盐流体培养基和大豆酪蛋白流体培养基中，置于37℃生化培养箱中进行培养，48-72h后观察结果，培养基仍为澄清则说明结果为阴性；支原体检测是：将Day12操作中取的细胞样本混匀，取适量用支原体检测试剂盒进行支原体检测；内毒素检测是：用鲎试剂凝胶法对细胞样本进行检测，执行内毒素标准≤0.25EU，操作如下：准品处理：向内毒素检测标准品加入BET水进行稀释，按照鲎试剂规格稀释成2λ的液体备用；鲎试剂处理：设置一组阴性对照一组阳性对照，加上Day14收获操作中取的细胞样本，每组两支，加入0.1mLBET水溶解，阳性对照组加入0.1mL2λ的标准品，阴性对照组加入0.1mLBET水；放在37℃培养箱中30min-60min，观察结果，阳性对照凝结，阴性对照和供试品组不凝结则说明供试品内毒素合格；细胞表型检测是：根据每种抗体1x106个细胞计算需要的细胞数，需要阴性对照管，生理盐水洗涤细胞，标记抗体，在4℃孵育30min，生理盐水清洗1-2次，去除未标记的抗体，流式细胞仪进行检测，将检测结果用相关软件进行分析，CD3+CD8+所占的比例≧90%为合格。4.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于培养过程中对全血、第一次细胞接种、细胞转袋培养、细胞收获前两天、出厂时分别做一次如下血平板检测；细...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵进军，何文丽，邱丽媛，谷广其，李亚平，王晶，
申请(专利权)人：中卫华医北京医院管理有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11
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