(R)‑3‑羟基丁酸的生产方法技术

本发明专利技术公开了一种通过微生物一步发酵生产(R)‑3‑羟基丁酸的方法，其采用无致病性的微生物，通过发酵直接将碳源和氮源转化为(R)‑3‑羟基丁酸，所生产的(R)‑3‑羟基丁酸可以进一步制成盐比如钠盐、钾盐、镁盐、钙盐等，用作药物活性成分或营养补充剂，具有广阔的工业应用前景。上述方法中使用的微生物包括通过基因工程构建的一种谷氨酸棒杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13957。

(R) method 3 hydroxy butyric acid production

The invention discloses a method for producing microbial fermentation by one step method (R) 3 hydroxy butyric acid, the use of non pathogenic microorganisms, through direct fermentation of carbon source and nitrogen source into (R) 3 hydroxybutyrate production (R) 3 hydroxybutyrate can enter step into salt such as sodium, potassium, magnesium salt, calcium salt, used as pharmaceutical active ingredients or nutritional supplements, has a broad prospect in industrial application. Using the method of microorganisms including constructed by gene engineering a Corynebacterium glutamicum, preserved in general center China microbial microbe preservation management committee, the preservation number is CGMCC No.13957.

【技术实现步骤摘要】
(R)-3-羟基丁酸的生产方法
本专利技术属于生物工程领域，具体地说，涉及一种通过微生物发酵生产(R)-3-羟基丁酸及其盐的方法。
技术介绍
(R)-3-羟基丁酸((R)-3-Hydroxybutyrate，3HB)是一种具有光学活性的手性化合物，CAS号为625-72-9。(R)-3-羟基丁酸是哺乳动物体内由肝脏内的长链脂肪酸代谢而产生的化合物，作为主要的酮体存在于血浆和外周组织中，可以用作身体大部分组织中的能量来源。(R)-3-羟基丁酸除了具有营养功能之外，还具有治疗许多疾病的作用，包括：1、可以治疗许多得益于酮体水平提高的疾病(如包括癫痫和肌阵挛的神经紊乱疾病以及包括阿尔兹默症和痴呆等的神经退化性疾病)；2、通过氧化辅酶Q来减少自由基伤害(如缺血症)；3、加强代谢效率(提高训练效率以及运动成绩，治疗供养不足、心绞痛、心肌梗塞等)；4、治疗如癌症尤其是脑癌(如星细胞瘤等)相关的疾病；5、对于糖代谢紊乱(如I型糖尿病、II型糖尿病、低血糖低酮体症等)具有很好的疗效；6、可以用于防治骨质减少(osteopenia)、骨质疏松症、重度骨质疏松症以及相关骨折等。基于这些功能，(R)-3-羟基丁酸及其盐可以用作食品添加剂和药物，具有巨大的保健和药用价值。(R)-3-羟基丁酸的制备主要为化学法，包括直接化学合成(R)-3-羟基丁酸、使用聚3-羟基丁酸解聚酶通过酶法降解聚3-羟基丁酸酯生产(R)-3-羟基丁酸。化学合成(R)-3-羟基丁酸的方法需要高温、高压的反应条件以及昂贵的手性金属催化剂等；而酶法降解聚3-羟基丁酸生产(R)-3-羟基丁酸需要耗费大量的有机溶剂，反应时间较长，并且需要高纯度的聚3-羟基丁酸酯作为起始物，并极易产生消旋化，但该方法目前还处于实验室水平，如果进入工业化大生产仍然存在成本高、产率低等问题。目前，市场上销售的大部分3-羟基丁酸为消旋体，即(R)-3-羟基丁酸和(S)-3-羟基丁酸的等量混合物。虽然研究表明(S)-3-羟基丁酸没有生理活性，但消旋的3-羟基丁酸及其盐尤其是钠盐目前仍然是主要的商品形式并被广大消费者接受。可以预期，单一光学活性的(R)-3-羟基丁酸及其盐今后应当会逐渐成为消费市场主流，取代无光学活性的3-羟基丁酸及其盐。人们普遍认为天然或生物来源的化合物更安全，对于药品、食品、化妆品成分的来源越来越追求“天然化”。出于市场推广目的，药品、食品、化妆品生产商都更乐意使用生物来源的产品来替代化学方法合成出来的相同物质。(R)-3-羟基丁酸作为广泛使用的天然化合物，寻找一种生物方法替代化学方法来生产已成为一种研究热点。
技术实现思路
为了实现生物方法来生产“安全无毒”的(R)-3-羟基丁酸，专利技术人对于微生物一步发酵法进行了探索，选择无致病性的微生物作为宿主，利用基因工程技术进行改造，通过增强与(R)-3-羟基丁酸生物合成相关的基因的表达，弱化分支代谢途径，筛选出高产(R)-3-羟基丁酸的生产菌株。这几种(R)-3-羟基丁酸生产菌在发酵过程中能有效地积累(R)-3-羟基丁酸，具有广阔的工业化应用前景。因此，本专利技术的第一个目的在于提供一种生产(R)-3-羟基丁酸的方法。本专利技术的第二个目的在于提供一种食品级的(R)-3-羟基丁酸及其盐。本专利技术的第三个目的在于提供食品级的消旋体3-羟基丁酸及其盐，以满足市场的需要。本专利技术的第四个目的在于提供一种(R)-3-羟基丁酸生产菌。本专利技术包括如下技术方案：一种生产(R)-3-羟基丁酸的方法，采用无致病性的微生物，通过发酵直接将碳源和氮源转化为(R)-3-羟基丁酸，所述微生物中产生的(R)-3-羟基丁酸分泌到发酵液中，从发酵液中提取纯化(R)-3-羟基丁酸，所述微生物选自谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、乳糖发酵短杆菌、散枝短杆菌、黄色短杆菌和产氨短杆菌，并且所述微生物具有下述依次进行的生物转化功能：使碳源与辅酶A转化为乙酰辅酶A；将乙酰辅酶A转化为乙酰乙酰辅酶A；将乙酰乙酰辅酶A转化为(R)-3-羟基丁酰辅酶A；将(R)-3-羟基丁酰辅酶A转化为(R)-3-羟基丁酸。优选地，所述微生物过表达一种以上选自下组的酶：琥珀酰辅酶A转移酶(Succinyl-CoAtransferase)、乙酰乙酰辅酶A合成酶(acetoacetyl-CoAsynthetase)、乙酰乙酰辅酶A还原酶(acetoacetyl-CoAreductase、硫酯酶(thioesterase)。更优选所述微生物过表达乙酰乙酰辅酶A合成酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶。优选地，所述微生物抑制或下调β-酮硫解酶(β-ketothiolase)的表达。在优选的实施方式中，所述微生物是谷氨酸棒杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.13957。发酵过程中，对于不同的微生物，可采用不同的培养基，其中所述碳源可以选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和甘油。发酵培养基中的氮源可以选自有机氮源和无机氮源，所述有机氮源选自玉米浆、麸皮水解液、豆饼水解液、酵母浸膏、酵母粉、蛋白胨和尿素；所述无机氮源选自硫酸铵、硝酸铵、或氨水。根据本专利技术的优选实施例，当微生物采用谷氨酸棒杆菌时，发酵培养基组成如下：葡萄糖75g/L、玉米浆25-30g/L、(NH4)2SO420g/L、KH2PO41.5g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、尿素1.0g/L、组氨酸30mg/L、糖蜜25g/L、生物素100μg/L，消泡剂0.2g/L。优选地，当发酵过程中进行补料，即采取分批补料培养方式时，所使用的补料培养基组成如下：硫酸铵500g/L、葡萄糖650g/L。本专利技术方法制备的(R)-3-羟基丁酸纯度达到95％以上、优选96％以上、97％以上、98％以上，更优选99％以上。通过上述方法制备的(R)-3-羟基丁酸不含细菌内毒素，并且无化学异味比如苦味和溶剂残留。(R)-3-羟基丁酸是一种酸，可以与碱形成盐。可选地，本专利技术的(R)-3-羟基丁酸呈盐的形式，比如钠盐、钾盐、镁盐、钙盐；优选钠盐。这些盐也都可以是光学活性化合物。考虑到消旋体3-羟基丁酸及其钠盐在传统上已经被食品和药品生产厂商、以及消费者所接受，可以对(R)-3-羟基丁酸及其盐经消旋化处理来制备外消旋的3-羟基丁酸及其盐。例如，通过将(R)-3-羟基丁酸在碱性溶液比如氢氧化钠溶液中加热并保温一定时间，可以实现消旋化。消旋体3-羟基丁酸盐可以是3-羟基丁酸钠、3-羟基丁酸钾、3-羟基丁酸镁、3-羟基丁酸钙或者上述混合盐。通过本专利技术的方法制备的(R)-3-羟基丁酸及其盐，不含细菌内毒素，也不包含有毒害性的化学物质，因此可以保障其食品安全性。另外，由于不含化学残留物或化学反应杂质，本专利技术的(R)-3-羟基丁酸不含化学异味比如苦味，可以直接用于制作药品和保健品。一种谷氨酸棒杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.13957。本专利技术所构建的(R)-3-羟基丁酸生产菌在发酵过程中能够实现发酵液中(R)-3-羟基丁酸的有效积累，得到食品级的(R)-3-羟基丁酸，因而具有广阔的工业应用前景。本专利技术构建的(R)-3-羟基丁酸高产基因工程菌的拉丁学名是Corynebacteriumglutamicum，中文本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产(R)‑3‑羟基丁酸的方法，采用无致病性的微生物，通过发酵直接将碳源和氮源转化为(R)‑3‑羟基丁酸，所述微生物中产生的(R)‑3‑羟基丁酸分泌到发酵液中，从发酵液中提取纯化(R)‑3‑羟基丁酸，所述微生物选自谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、乳糖发酵短杆菌、散枝短杆菌、黄色短杆菌和产氨短杆菌，并且所述微生物具有下述依次进行的生物转化功能：使碳源与辅酶A转化为乙酰辅酶A；将乙酰辅酶A转化为乙酰乙酰辅酶A；将乙酰乙酰辅酶A转化为(R)‑3‑羟基丁酰辅酶A；将(R)‑3‑羟基丁酰辅酶A转化为(R)‑3‑羟基丁酸。

【技术特征摘要】
1.一种生产(R)-3-羟基丁酸的方法，采用无致病性的微生物，通过发酵直接将碳源和氮源转化为(R)-3-羟基丁酸，所述微生物中产生的(R)-3-羟基丁酸分泌到发酵液中，从发酵液中提取纯化(R)-3-羟基丁酸，所述微生物选自谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、乳糖发酵短杆菌、散枝短杆菌、黄色短杆菌和产氨短杆菌，并且所述微生物具有下述依次进行的生物转化功能：使碳源与辅酶A转化为乙酰辅酶A；将乙酰辅酶A转化为乙酰乙酰辅酶A；将乙酰乙酰辅酶A转化为(R)-3-羟基丁酰辅酶A；将(R)-3-羟基丁酰辅酶A转化为(R)-3-羟基丁酸。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物过表达一种以上选自下组的酶：琥珀酰辅酶A转移酶、乙酰乙酰辅酶A合成酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶、硫酯酶。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物过表达乙酰乙酰辅酶A合成酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述微生物是谷氨酸棒杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中...

【专利技术属性】
技术研发人员：范文超，
申请(专利权)人：湖州恒睿营养健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33