一种脱细胞基质材料中纤维连接蛋白的定量检测方法及应用技术

本发明专利技术提供一种脱细胞基质材料中纤维连接蛋白的定量检测方法及应用。所述定量检测方法包括对脱细胞基质的预处理、分步酶解方法和质谱检测过程，通过脱细胞基质的预处理、分步酶解方法获得纤维连接蛋白的所有多肽序列混合物，再筛选纤维连接蛋白中的特征多肽序列，通过质谱法检测特征多肽含量，从而测定出脱细胞基质中纤维连接蛋白含量。该方法解决了以往无法使用质谱法定量检测脱细胞基质中组织型纤维连接蛋白含量的问题；进一步地，通过分步酶解的方式去除脱细胞基质中胶原蛋白成分、减少测试过程非目标蛋白多肽序列的干扰，从而节约了测试时间，提高工作效率、检测精度和稳定性。

【技术实现步骤摘要】
一种脱细胞基质材料中纤维连接蛋白的定量检测方法及应用
本专利技术涉及一种蛋白质检测方法及其应用，具体地，本专利技术涉及一种利用质谱技术通过检测特征多肽检测脱细胞基质材料中纤维连接蛋白含量的方法。技术背景小肠粘膜下层基质(SmallIntestinalSubmucosa，SIS)材料是指小肠粘膜下层经脱细胞等方法处理后去除免疫原性物质后的所得到的生物材料，广泛用于各种软组织缺损的修复，具有诱导细胞粘附生长、促进组织再生和重建等功能。SIS材料作为外科植入物已成功用于神经、腹壁、硬脑膜、肌腱、泌尿道、鼓膜等组织缺损的修复，具有安全有效、术后并发症少、感染率低、患者满意度高等优点，证实了SIS材料是一种理想的用于组织缺损修复和重建的无免疫排斥的动物源性植入材料。SIS基质材料作为一种脱细胞基质主要成分为胶原蛋白，并包含非胶原类的结构蛋白和生物粘多糖。其中胶原蛋白主要由I型和III型组成，非胶原类蛋白主要包括纤维连接蛋白(Fibronectin，FN)、层粘连蛋白和生长因子等。FN是一种糖蛋白，由两个分子量为220kDa的亚基以二硫键连接的二聚体形式存在，主要由成纤维细胞、内皮细胞、软骨本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测脱细胞基质中纤维连接蛋白含量的方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：(1)预处理：称取一定重量的脱细胞基质，将其剪成尺寸小于1cm×1cm的小片，在液氮保护条件下粉碎成粉末，粉末尺寸控制在50‑300μm；(2)酶解1：取一定量粉碎后脱细胞基质粉末，加入到脱细胞基质粉末重量500‑10000倍的缓冲液，在100℃热处理5‑10min，冷却后加入脱细胞基质重量1/200～1/50的胶原酶，于37℃振荡处理2‑24h；(3)酶解2：将步骤(2)获得的溶液pH调节至7.5‑8.5，加入非胶原类蛋白酶，非胶原类蛋白酶的加入量为脱细胞基质重量的1/200～1/50，于37℃反应8‑24h；(...

【技术特征摘要】
1.一种检测脱细胞基质中纤维连接蛋白含量的方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：(1)预处理：称取一定重量的脱细胞基质，将其剪成尺寸小于1cm×1cm的小片，在液氮保护条件下粉碎成粉末，粉末尺寸控制在50-300μm；(2)酶解1：取一定量粉碎后脱细胞基质粉末，加入到脱细胞基质粉末重量500-10000倍的缓冲液，在100℃热处理5-10min，冷却后加入脱细胞基质重量1/200～1/50的胶原酶，于37℃振荡处理2-24h；(3)酶解2：将步骤(2)获得的溶液pH调节至7.5-8.5，加入非胶原类蛋白酶，非胶原类蛋白酶的加入量为脱细胞基质重量的1/200～1/50，于37℃反应8-24h；(4)质谱检测：将步骤(3)获得的酶解溶液进行浓缩，浓缩液直接进行质谱分析，以已知浓度的纤维连接蛋白标准品溶液的酶解产物为对照，检测特征多肽，通过测定脱细胞基质降解产物中纤维连接蛋白特征多肽计算脱细胞基质中纤维连接蛋白的含量。2.根据权利要求1所述的一种检测脱细胞基质中纤维连接蛋白含量的方法，其特征在于，所述步骤(2)酶解过程中使用的胶原酶可以是I型、II型、III型、V型或不同类型胶原酶的混合物，加入量是脱细胞基质重量的1/200～1/50。3.根据权利要求1所述的一种检测脱细胞基质中纤维连接蛋白含量的方法，其特征在于，所述步骤(3)酶解过程中使用的蛋白酶可以是胰蛋白酶、化学修饰后的胰蛋白酶或固定化的胰蛋白酶，加入量是脱细胞基质重量的1/200～1/50。4.根据权利要求1所述的一种检测脱细胞基质中纤维连接蛋白含量的方法，其特征在于，所述步骤(4)中用于检测脱细胞基质中纤维连接蛋白的特征多肽包括：FTQVTPTSLTAQWTAPNVQLTGYR、EINLAPDSS...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵博，张贵锋，陈毅，夏磊磊，赵延瑞，张扬，
申请(专利权)人：北京博辉瑞进生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11