一种艾伯特埃希菌的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种艾伯特埃希菌的检测方法，所述方法包括基于eae基因PCR初筛、乳糖不发酵等特点的艾伯特埃希菌分离培养初筛程序；诊断性三重PCR、基于16S rDNA序列分析、MLST分析的艾伯特埃希菌的鉴定程序。本发明专利技术利用了艾伯特埃希菌在低温时仍能生长的特性，通过降低一次增菌的温度至20℃，抑制了大肠杆菌的生长，此时艾伯特埃希菌成为该温度下生长的优势菌，进而使得艾伯特埃希菌一次增菌中的菌体浓度提高6个滴度(10

【技术实现步骤摘要】
一种艾伯特埃希菌的检测方法
本专利技术涉及细菌检测领域，具体涉及一种艾伯特埃希菌的检测方法。
技术介绍
艾伯特埃希菌(Escherichiaalbertii)是近年来发现和命名的一个新种，为与人散发肠道感染及突发食源性腹泻事件有关的肠道致病菌。由于食品或人的粪便样品中含有的细菌种类多样，其中大肠杆菌无处不在，艾伯特埃希菌与大肠杆菌同属于埃希氏菌属，在生化和菌株培养特性上有很多相似性，在37℃培养时以大肠杆菌生长最为旺盛，抑制了艾伯特埃希菌的生长，使得艾伯特埃希菌的检出率大大降低。目前国外有12个国家开展了此菌的研究，而国内只有自贡市疾病预防控制中心开展了此菌的研究。目前现有技术中有两种艾伯特埃希菌的培养方法，1)含有艾伯特埃希菌的动物样品(鸡肉与内脏、野生家养鸟肠内容物或粪便)在BPW或MAC培养基或者EC肉汤中35℃或42℃培养18h或24h，进行一次增菌；2)含有艾伯特埃希菌的病人样品(粪便)在TSB或DHL培养基中37℃培养18h～24h进行一次增菌。但上述两种方法在实验过程中以发酵乳糖的优势大肠杆菌增菌为主，MAC平板上不发酵乳糖的无色菌落很少(95％以上的艾伯特埃希菌株不发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种艾伯特埃希菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)按照1:10的重量百分比采集25g食品+225ml EC肉汤增菌液；3ml脑心‑甘油肉汤保存液+2ml稀大便或2g干粪便的混合液+9ml EC肉汤增菌液，于20℃培养18‑36h；2)取1ml上述EC肉汤增菌液，8000rpm离心3min集菌，弃上清；用150μl裂解液悬菌，振荡使沉淀充分混匀，水煮10min；12000rpm离心5min，取上清即为PCR反应模板；eae基因PCR初筛引物为eae‑F:CAGGATCGCCTTTTTTATACG和eae‑R:CTCTGCAGATTAACCTCTGC进行PCR初筛；PCR反应体系为：在20...

【技术特征摘要】
1.一种艾伯特埃希菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)按照1:10的重量百分比采集25g食品+225mlEC肉汤增菌液；3ml脑心-甘油肉汤保存液+2ml稀大便或2g干粪便的混合液+9mlEC肉汤增菌液，于20℃培养18-36h；2)取1ml上述EC肉汤增菌液，8000rpm离心3min集菌，弃上清；用150μl裂解液悬菌，振荡使沉淀充分混匀，水煮10min；12000rpm离心5min，取上清即为PCR反应模板；eae基因PCR初筛引物为eae-F:CAGGATCGCCTTTTTTATACG和eae-R:CTCTGCAGATTAACCTCTGC进行PCR初筛；PCR反应体系为：在20μl体系中，2×TaqMasterMix10μl，10μM上、下游引物各1μl，DNA模板1μl，纯水7μl；PCR反应条件：预变性94℃2min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃45s，30次循环，最后延伸72℃5min，每次实验均设有阴、阳性对照；PCR产物以1.5wt％琼脂糖凝胶进行电泳检测；3)用接种环挑取3环上述初筛eae阳性增菌保存液，分离划线于3个麦康凯平板上，36℃，24h；可疑菌落为在平板上呈凸起、边缘整齐、无色的较大菌落；然后挑出不少于30个的可疑无色菌落，每一个单个可疑无色菌落的二分之一作为PCR反应模板检测eae基因；且每一个单个可疑无色菌落的另二分之一用于后续纯培养；4)接种eae阳性单菌落于营养琼脂平板36℃纯培养24h，纯培养物分别接种于木糖和乳糖发酵管，并用软琼脂检测动力，36℃培养，24h后观察结果；5)将上述eae基因阳性、不发酵乳糖、不发酵木糖、动力阴性的菌落作为疑似艾伯特埃希菌；无菌接种环挑取少量纯培养物菌苔于含有500μl去离子水的1.5ml离心管中重悬，煮沸10min，12000rpm离心3min，取上清液做PCR模板，用于后续的诊断性三重PCR鉴定、16SrDNA序列分析及MLST分析。2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤1)中，所述食品选自生牛肉、生猪肉、生羊肉、生鸡肉、生鸭肉、新鲜鸡肠或新鲜鸭肠；所述家禽家畜选自鸡、鸭或家养鸽子；所述野生鸟类选自白鹭、麻雀或燕子；所述2ml稀大便或2g干粪便来自腹泻患者、家禽家畜、野生鸟类粪便标本。3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤2)中，所述裂解液的配方为：100mMNaCl，10mMTris-HCl[pH8.3]，1mMEDTA[pH9.0]，1wt％TritonX-100。4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤5)中，用10μl一次性无菌接种环挑取15mm纯培养物菌苔于含有500μl去离子水的1.5ml离心管中重悬，煮沸10min，12000rpm离心3min。5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤5)中，所述诊断性三重PCR鉴定具体为：采用艾伯特埃希菌管家基因clpx、lysP和mdh建立的三重PCR检测方法，如3个基因均阳性，可初步确认为艾伯特...

【专利技术属性】
技术研发人员：王红，李群，熊衍文，刘祥，张正东，张玲，邹年莉，闫国栋，
申请(专利权)人：自贡市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：四川,51