艾伯特埃希氏菌的免疫磁珠分离及检测方法技术

本发明专利技术涉及艾伯特埃希氏菌的免疫磁珠分离及检测方法。通过分别制备特异性结合艾伯特埃希氏菌的O1～O7血清型的多克隆抗体并将多克隆抗体与磁珠偶联，制备了能够特异性吸附艾伯特埃希氏菌O1～O7血清型的免疫磁珠。艾伯特埃希氏菌免疫磁珠能够从肠道菌群中特异灵敏地吸附并分离艾伯特埃希氏菌。本发明专利技术还提供了基于免疫磁珠分离的艾伯特埃希氏菌的检测方法，利用免疫磁珠特异灵敏地分离和富集样品中的艾伯特埃希氏菌，再结合eae基因的PCR检测，与传统的分离检测方法相比，该方法能够显著提高艾伯特埃希氏菌的阳性检出率，且大大节省了物料、时间和人力成本，实现艾伯特埃希氏菌的快速准确检测。

【技术实现步骤摘要】
艾伯特埃希氏菌的免疫磁珠分离及检测方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及艾伯特埃希氏菌的免疫磁珠分离及检测方法。
技术介绍
艾伯特埃希氏菌(Escherichiaalbertii)是近年发现和命名的一个新的与人散发肠道感染及突发食源性腹泻有关的肠道致病菌。1991年，Albert等首次分离到艾伯特埃希氏菌。2003年，Huys等通过表型及基因型分析将其确定为埃希氏菌属中的一个新种，并命名为E.albertii(艾伯特埃希氏菌)。此外，国外学者也陆续从家禽家畜，野生动物，鸟类等动物宿主分离出艾伯特埃希氏菌。经多年研究，本申请专利技术人首次在中国的腹泻患者、健康人群、野生白鹭、家禽和动物源性食品中分别证实了艾伯特埃希氏菌的存在，并获得我国不同来源的艾伯特埃希氏菌分离株62株，这些菌株的多位点序列分析(MLST)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)型别具有明显的多样性。本申请专利技术人的监测研究结果提示艾伯特埃希氏菌在我国存在着较大的人间感染的风险。在前期研究工作中，本申请专利技术人在62株国内艾伯特埃希氏菌分离株中首次发现了艾伯特埃希氏菌的7个血清型，命名为O1～O7血清型。由于艾伯特埃希氏菌与大肠杆菌同属于埃希氏菌属细菌，两者在生化和菌株培养特性上有很多相似性，传统的平板培养分离方法中，大肠杆菌的干扰和抑制使得艾伯特埃希氏菌的检出率大大降低。因此，开发艾伯特埃希氏菌的高效分离和检测方法具有重要意义。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供艾伯特埃希氏菌的免疫磁珠分离及检测方法。艾伯特埃希氏菌与大肠杆菌同属于埃希氏菌属细菌，两者在生化和菌株培养特性上有很多相似性，但大肠杆菌会明显抑制艾伯特埃希氏菌的生长，导致艾伯特埃希氏菌在微生物群落中成为弱势菌群，分离培养较为困难。专利技术人在对艾伯特埃希氏菌检测方法的研究过程中发现，在平板培养前，先利用免疫磁珠特异性地吸附艾伯特埃希氏菌，艾伯特埃希氏菌的分离和检测的效率大大提高。目前现有技术中没有关于艾伯特埃希氏菌的免疫磁珠的研究，专利技术人发现利用专利技术人前期分离得到的7种血清型的艾伯特埃希氏菌的多克隆抗体，制备特异性结合艾伯特埃希氏菌的免疫磁珠，能够实现不同血清型艾伯特埃希氏菌的有效分离。但是在保证抗艾伯特埃希氏菌的抗体效价的基础上，采用常用的其它细菌的免疫磁珠的制备方法并不能得到活性较好的艾伯特埃希氏菌免疫磁珠。在制备偶联抗艾伯特埃希氏菌抗体的免疫磁珠的过程中，抗艾伯特埃希氏菌的抗体与磁珠的质量比对于艾伯特埃希氏菌免疫磁珠的吸附活性影响十分显著。一方面，本专利技术提供一种艾伯特埃希氏菌免疫磁珠的制备方法，为将抗艾伯特埃希氏菌的抗体与磁珠偶联，所述偶联为将所述抗艾伯特埃希氏菌的抗体与活化的磁珠按照每毫克磁珠加入15～35μg抗艾伯特埃希氏菌的抗体的质量比混合。具体地，所述制备方法包括如下步骤：(1)制备抗艾伯特埃希氏菌的抗体，所述抗艾伯特埃希氏菌的抗体为抗艾伯特埃希氏菌O1～O7血清型多克隆抗体中的一种或多种；(2)将所述抗艾伯特埃希氏菌的抗体与活化的磁珠按照每毫克磁珠加入15～35μg抗艾伯特埃希氏菌的抗体的质量比混合并进行偶联反应，优选地，所述质量比为每毫克磁珠加入25～35μg抗艾伯特埃希氏菌的抗体；(3)将步骤(2)得到的抗体偶联磁珠进行封闭与分离，即得艾伯特埃希氏菌免疫磁珠。优选地，所述偶联反应为在28～37℃条件下，反应12～20h。优选地，所述艾伯特埃希氏菌O1～O7血清型的代表菌株为SP140089、SP150020、SP140724、D140513、T150248、T150072和ZG141049。进一步地，本专利技术提供由所述制备方法制备得到的艾伯特埃希氏菌免疫磁珠，以及包括所述艾伯特埃希氏菌免疫磁珠的免疫磁珠检测试剂盒。优选地，免疫磁珠检测试剂盒所述还包括用于PCR扩增艾伯特埃希氏菌eae基因的引物；更优选地，所述引物序列如下：SEQIDNO.1:eae-F:CAGGATCGCCTTTTTTATACG；SEQIDNO.2:eae-R:CTCTGCAGATTAACCTCTGC。本申请提供的偶联抗艾伯特埃希氏菌抗体的免疫磁珠能够特异性地吸附艾伯特埃希氏菌，从而实现样品中艾伯特埃希氏菌的分离和富集，提高艾伯特埃希氏菌的检测的灵敏度和检出率。因此，本专利技术提供所述的艾伯特埃希氏菌免疫磁珠或所述的检测试剂盒在分离和/或检测艾伯特埃希氏菌中的应用。另一方面，本专利技术提供一种艾伯特埃希氏菌的分离或富集的方法，为利用本专利技术所述的艾伯特埃希氏菌免疫磁珠或所述的检测试剂盒进行艾伯特埃希氏菌的分离或富集。优选地，所述艾伯特埃希氏菌的分离，为在每毫升菌液样品中等量加入100～1000μg的偶联抗艾伯特埃希氏菌O1～O7血清型的多克隆抗体的7种免疫磁珠，所述菌液样品的菌体浓度不低于10cfu/mL；所述分离或富集为在室温条件下进行。更优选地，所述艾伯特埃希氏菌的分离，为在每毫升菌液样品中等量加入250～600μg的偶联抗艾伯特埃希氏菌O1～O7血清型的多克隆抗体的7种免疫磁珠，所述菌液样品的菌体浓度不低于10cfu/mL；所述分离或富集为在室温条件下进行。本专利技术还提供一种艾伯特埃希氏菌的检测方法，其为利用本专利技术所述的艾伯特埃希氏菌免疫磁珠或所述的检测试剂盒，先进行艾伯特埃希氏菌的免疫磁珠吸附分离，再进行艾伯特埃希氏菌的检测。具体地，所述艾伯特埃希氏菌的检测方法包括如下步骤：(1)将样品进行增菌培养；(2)对步骤(1)获得的菌液进行eae基因的PCR检测筛选；(3)对于eae基因PCR检测为阳性的菌液样品，利用本专利技术所述的艾伯特埃希氏菌免疫磁珠或所述的检测试剂盒进行艾伯特埃希氏菌的免疫磁珠吸附分离；(4)将免疫磁珠与菌液样品分离，将分离的磁珠重悬后，接种至麦康凯固体培养基进行培养；(5)对培养获得的单菌落进行eae基因的PCR检测，和/或，clpX基因、lysP基因以及mdh基因的三重PCR检测。优选地，在进行所述艾伯特埃希氏菌的免疫磁珠吸附分离时，每毫升菌液样品等量加入100～1000μg的偶联抗艾伯特埃希氏菌O1～O7血清型的多克隆抗体的7种免疫磁珠，所述菌液样品的菌体浓度不低于10cfu/mL。所述clpX基因、lysP基因以及mdh基因的三重PCR检测使用的引物序列如下：clpX基因：F:TGGCGTCGAGTTGGGCA(SEQIDNO.3)R:TCCTGCTGCGGATGTTTACG(SEQIDNO.4)lysP基因：F:GGGCGCTGCTTTCATATATTCTT(SEQIDNO.5)R:TCCAGATCCAACCGGGAGTATCAGGA(SEQIDNO.6)mdh基因：F:CTGGAAGGCGCAGATGTGGTACTGATT(SEQIDNO.7)R:CTTGCTGAACCAGATTCTTCACAATACCG(SEQIDNO.8)本领域技术人员应该理解，本专利技术提供的检测方法为艾伯特埃希氏菌的检测方法，本专利技术的目的在于利用免疫磁珠吸附分离来提高艾伯特埃希氏菌的检出率，在免疫磁珠吸附分离后，本专利技术提供的检测方法仅涉及eae基因的PCR检测以及clpX基因、lysP基因以及mdh基因三重PCR检测，本领域技术人员可以根据实际需要和不同的目的，在免疫磁珠特异地分离艾伯本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种艾伯特埃希氏菌免疫磁珠的制备方法，其特征在于，为将抗艾伯特埃希氏菌的抗体与磁珠偶联，所述偶联为将所述抗艾伯特埃希氏菌的抗体与活化的磁珠按照每毫克磁珠加入15～35μg抗艾伯特埃希氏菌的抗体的质量比混合。

【技术特征摘要】
1.一种艾伯特埃希氏菌免疫磁珠的制备方法，其特征在于，为将抗艾伯特埃希氏菌的抗体与磁珠偶联，所述偶联为将所述抗艾伯特埃希氏菌的抗体与活化的磁珠按照每毫克磁珠加入15～35μg抗艾伯特埃希氏菌的抗体的质量比混合。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制备抗艾伯特埃希氏菌的抗体，所述抗艾伯特埃希氏菌的抗体为抗艾伯特埃希氏菌O1～O7血清型多克隆抗体中的一种或多种；(2)将所述抗艾伯特埃希氏菌的抗体与活化的磁珠按照每毫克磁珠加入15～35μg抗艾伯特埃希氏菌的抗体的质量比混合并进行偶联反应，优选地，所述质量比为每毫克磁珠加入25～35μg抗艾伯特埃希氏菌的抗体；(3)将步骤(2)得到的抗体偶联磁珠进行封闭与分离，即得艾伯特埃希氏菌免疫磁珠。3.权利要求1或2所述的制备方法制备得到的艾伯特埃希氏菌免疫磁珠。4.一种艾伯特埃希氏菌的免疫磁珠检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的艾伯特埃希氏菌免疫磁珠。5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括用于PCR扩增艾伯特埃希氏菌eae基因的引物；优选地，所述引物序列如下：SEQIDNO.1:eae-F:CAGGATCGCCTTTTTTATACG；SEQIDNO.2:eae-R:CTCTGCAGATTAACCTCTGC。6.权利要求3所述的艾伯特埃希氏菌免疫磁珠或权利要求4或5所述的检测试剂盒在分离和/或检测艾伯特埃希氏菌中的应用。7.一种艾伯特埃希氏菌的分离或富集...

【专利技术属性】
技术研发人员：李群，王红，熊衍文，郑翰，邹年莉，闫国栋，张玲，赵艺，曾妮，陈弘汐，
申请(专利权)人：自贡市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：四川,51