本发明专利技术涉及分子生物学领域，公开了一种快速检测识别水产品中耐药菌多样性的方法。先用不同类型和浓度的抗生素筛选，从水产样品中分离耐药性程度不同的耐药菌，提取DNA，根据细菌16S rDNA V3可变区设计一对通用引物进行PCR扩增，DGGE电泳分离片段并回收；再次扩增后测序，可实现快速检测水产品中耐药菌多样性。本方法成本低、容易操作，能够直观、快速地观察到水产品中不同耐药菌的种类和群落结构；实现对不同地方和不同来源的水产品中耐药菌中生物群落的多样性和动力学变化进行比较直观的分析。
【技术实现步骤摘要】
一种快速检测水产品中耐药菌多样性的方法
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种利用PCR-DGGE快速识别水产品中耐药菌多样性的方法。
技术介绍
我国是世界上抗生素的最大生产国与消费国，过量使用或滥用抗生素现象较为普遍.根据国家食品药品监督管理局的统计数据，我国每年人均消费抗生素138g，是美国人的10倍。抗生素广泛用于人类和动物(畜禽/鱼)的疾病防治或动物的促进长，然而，长期过量使用或滥用抗生素会对环境和人类健康构成巨大的潜在威胁，这是因为大部分的抗生素以原药及其代谢产物的方式随人、畜禽和鱼的排泄物最终进入自然环境，导致细菌耐药性增强，甚至出现超级细菌，严重威胁人类健康。在实际的生产生活中，为了达到某种目的获得最大经济效益，人们往往认为加大抗生素的用量可以减少养殖损失，甚至盲目的错误使用抗生素的种类，导致抗生素滥用现象越来越严重，不仅危害人类的健康，对生态环境也造成了不可估量的损害。抗生素的频繁使用导致致病微生物的“伪耐久性”，会对水产动物和环境中细菌产生选择性压力，可能导致环境中的细菌成为耐药菌。抗生素的频繁使用导致致病微生物的“伪耐久性”，在水环境中，可施加选择性压力使水产动物和环境产生耐药菌。抗菌药物在水产养殖中应用不当或增加导致细菌抗菌素耐药性的演变和传播，细菌的耐药性已经成为全球范围内极其严重的公共卫生安全问题，抗菌素耐药性致病菌构成一近几十年来最严重的威胁人类健康。细菌产生对抗生素的耐药性会增加治疗成本，因为致病微生物的耐药性会导致治疗的失败，人类和动物病原体的抗生素耐药性的传播成为关注的重点。水产品是食品链的一部分，抗生素可以因食物的生产加工以及人的肠胃道进行转移交换，从而进行传播。因此，从水产品中的分离病原菌并获得其耐药性和参数检测对人类健康、海鲜质量保护非常重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种PCR-DGGE技术快速检测水产品耐药菌多样性的方法，以实现对水产品中不同抗生素耐药菌筛选。本专利技术基于PCR-DGGE的方法，可实现快速检测水产品不同程度的耐药菌多样性。技术方案为，先用不同类型和浓度的抗生素筛选，从水产样品中分离耐药性程度不同的耐药菌，提取DNA，根据细菌16SrDNAV3可变区设计一对通用引物进行PCR扩增，DGGE电泳分离片段并回收；再次扩增后测序，可实现快速检测水产品中耐药菌多样性。快速检测水产品中耐药菌多样性的方法，步骤包括：(1)水产品样品匀浆并涂布在含不同浓度、类型抗生素的培养基上培养；(2)分别提取收集菌体，获得水产品中的总菌及耐受不同浓度、类型抗生素的耐药菌，并提取DNA；(3)PCR扩增并纯化；(4)DGGE电泳和成像；(5)回收目的条带，获取总菌和耐药菌DNA重新扩增并测序；(6)分析测序结果，确定水产品样品中筛选的总菌和耐药菌特异性菌株，判断不同选择条件下水产品样品的菌株及其多样性。分析的方法包括：NCBIBlast程序进行相似性分析、香农-威纳指数分析以及PCoA分析等。可以采用QuantityOne分析软件，对样品丰富度、均匀度进行分析。步骤(1)中，水产品样品与0.8％～0.9％NaCl溶液按1：6～10重量比混合拍打匀浆后稀释8～12倍，涂布于平板培养。35℃～38℃下培养18～24h；优选的培养温度为37℃。步骤(1)中，抗生素的浓度梯度范围为相应水产品EC50值的10％～300％，优选为EC50值的25％～200％，更优选为EC50值的50％～150％。所述的抗生素为磺胺嘧啶、四环素、链霉素中的至少一种。步骤(2)中，用0.8％～0.9％NaCl洗涤平板，收集菌体。步骤(3)中，根据细菌16SrDNAV3可变区设计一对通用引物进行PCR扩增，其中在上游引物5’末端添加一个30-40bp的GC发卡结构。优选的，PCR扩增的引物为，341F-GC：5-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3及518R：5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3，即SEQIDNo.1和SEQIDNo.2。其中GC发卡结构的序列为5-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGG-3。步骤(2)的PCR扩增条件为：93～95℃预变性3～7min；93～95℃变性25～35s，64～66℃退火55s～1min，70～73℃延伸50s～1min，16～25个循环；93～95℃变性25～35s，54～56℃退火55s～1min，70～73℃延伸50s～1min，8～12个循环；72℃延伸8～15min。步骤(3)优选的PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火1min，72℃延伸1min，20个循环；94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，10个循环；72℃延伸10min。步骤(4)中，DGGE电泳条件为：聚丙烯酰胺凝胶浓度8％，凝胶变性梯度为35％～55％，变性方向与电泳方向一致；在电泳温度为60℃、100V条件下电泳8～12h，优选为10h。用SYBRgreenI染色20min。照胶仪紫外灯下凝胶成像，并用软件Bio-RadQuantityOne4.6进行图像分析，其中每条DGGE泳道代表总菌和不同浓度抗生素筛出的耐药菌样品，不同位置条带代表不同的细菌，而条带亮度反映细菌的相对量。变性剂为7mol/L尿素和40％体积浓度去离子甲酰胺。步骤(5)中，将总菌和不同耐药菌DGGE图谱中清晰的共性和特异条带标记割胶回收并扩增。扩增的引物序列为：上游引物F341：5-CCTACGGGAGGCAGCAG-3，下游引物R518：5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3。步骤(5)扩增的条件为：93～95℃预变性3～7min；93～95℃变性25～35s，64～66℃退火55s～1min，70～73℃延伸50s～1min，16～25个循环；93～95℃变性25～35s，54～56℃退火55s～1min，70～73℃延伸50s～1min，8～12个循环；72℃延伸8～15min。优选的，步骤(5)扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，65℃退火1min，72℃延伸1min，20个循环；94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，10个循环；72℃延伸10min。步骤(5)扩增后的产物与载体连接，并转化感受态细胞，挑选阳性克隆子进行测序。步骤(6)中，对测序的结果利用NCBIBlast程序进行相似性分析，确定从水产品样品中筛出总菌和耐药菌的特异性菌株；对照DGGE图谱可以看出条带的数目、亮度、位置等特异型数据，从而获得不同选择条件下水产品中样品的菌株及其多样性。本专利技术的一个具体实施方式中，水产品为南美白对虾，用来筛选的抗生素为磺胺嘧啶、四环素、链霉素及其混合物。本专利技术首先对水产品样品中进行不同抗生素浓度的耐药菌进行筛选，筛出不同程度的耐药总菌，对于不同浓度筛出的耐药菌其里面的菌株是多样性的。为了探究所筛出的耐药菌之间的差异性，通过PCR-DGGE对其生物群落的多样性和动力学变化具体分析，可以看出在不同选择条件下水产品中样品的菌株以及在不同抗生素浓度的选择条件下菌株的多样性。该方法具有成本低，易操作等优点。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速检测水产品中耐药菌多样性的方法，其特征在于，步骤包括：(1)水产品样品匀浆并涂布在含不同浓度、类型抗生素的培养基上培养；(2)分别提取收集菌体，获得水产品中的总菌及耐受不同浓度、类型抗生素的耐药菌，并提取DNA；(3)PCR扩增并纯化；(4)DGGE电泳和成像；(5)回收目的条带，获取总菌和耐药菌DNA重新扩增并测序；(6)分析测序结果，确定水产品样品中筛选的总菌和耐药菌特异性菌株，判断不同选择条件下水产品样品的菌株及其多样性。
【技术特征摘要】
1.一种快速检测水产品中耐药菌多样性的方法，其特征在于，步骤包括：(1)水产品样品匀浆并涂布在含不同浓度、类型抗生素的培养基上培养；(2)分别提取收集菌体，获得水产品中的总菌及耐受不同浓度、类型抗生素的耐药菌，并提取DNA；(3)PCR扩增并纯化；(4)DGGE电泳和成像；(5)回收目的条带，获取总菌和耐药菌DNA重新扩增并测序；(6)分析测序结果，确定水产品样品中筛选的总菌和耐药菌特异性菌株，判断不同选择条件下水产品样品的菌株及其多样性。2.权利要求1所述快速检测水产品中耐药菌多样性的方法，其特征在于，步骤(1)中，抗生素的浓度梯度范围为EC50值的10％～300％。3.权利要求1所述快速检测水产品中耐药菌多样性的方法，其特征在于，步骤(3)所述PCR扩增的上游引物包含以下序列：5-CCTACGGGAGGCAGCAG-3；并且还含有35-40bp的GC发夹结构；下游引物包含以下序列：5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3；所述PCR扩增的条件为：93～95℃预变性3～7min；93～95℃变性25～35s，64～66℃退火55s～1min，70～73℃延伸50s～1min，16～25个循环；93～95℃变性25～35s，54～56℃退火55s～1min，70～73℃延伸50s～1min，8～12个循环；72℃延伸8～15min。4.权利要求1或3所述快速检测水产品中耐药菌多样性的方法，其特征在于，步骤(3)所述PCR扩增的上游引物序列为5-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCA...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵勇，牛丽，巴永兵，赵飞，刘海泉，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海,31
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