一种快速检测水产品中耐药菌多样性的方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，公开了一种快速检测识别水产品中耐药菌多样性的方法。先用不同类型和浓度的抗生素筛选，从水产样品中分离耐药性程度不同的耐药菌，提取DNA，根据细菌16S rDNA V3可变区设计一对通用引物进行PCR扩增，DGGE电泳分离片段并回收；再次扩增后测序，可实现快速检测水产品中耐药菌多样性。本方法成本低、容易操作，能够直观、快速地观察到水产品中不同耐药菌的种类和群落结构；实现对不同地方和不同来源的水产品中耐药菌中生物群落的多样性和动力学变化进行比较直观的分析。

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测水产品中耐药菌多样性的方法
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种利用PCR-DGGE快速识别水产品中耐药菌多样性的方法。
技术介绍
我国是世界上抗生素的最大生产国与消费国，过量使用或滥用抗生素现象较为普遍.根据国家食品药品监督管理局的统计数据，我国每年人均消费抗生素138g，是美国人的10倍。抗生素广泛用于人类和动物(畜禽/鱼)的疾病防治或动物的促进长，然而，长期过量使用或滥用抗生素会对环境和人类健康构成巨大的潜在威胁，这是因为大部分的抗生素以原药及其代谢产物的方式随人、畜禽和鱼的排泄物最终进入自然环境，导致细菌耐药性增强，甚至出现超级细菌，严重威胁人类健康。在实际的生产生活中，为了达到某种目的获得最大经济效益，人们往往认为加大抗生素的用量可以减少养殖损失，甚至盲目的错误使用抗生素的种类，导致抗生素滥用现象越来越严重，不仅危害人类的健康，对生态环境也造成了不可估量的损害。抗生素的频繁使用导致致病微生物的“伪耐久性”，会对水产动物和环境中细菌产生选择性压力，可能导致环境中的细菌成为耐药菌。抗生素的频繁使用导致致病微生物的“伪耐久性”，在水环境中，可施加选择性压力使水产本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测水产品中耐药菌多样性的方法，其特征在于，步骤包括：(1)水产品样品匀浆并涂布在含不同浓度、类型抗生素的培养基上培养；(2)分别提取收集菌体，获得水产品中的总菌及耐受不同浓度、类型抗生素的耐药菌，并提取DNA；(3)PCR扩增并纯化；(4)DGGE电泳和成像；(5)回收目的条带，获取总菌和耐药菌DNA重新扩增并测序；(6)分析测序结果，确定水产品样品中筛选的总菌和耐药菌特异性菌株，判断不同选择条件下水产品样品的菌株及其多样性。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测水产品中耐药菌多样性的方法，其特征在于，步骤包括：(1)水产品样品匀浆并涂布在含不同浓度、类型抗生素的培养基上培养；(2)分别提取收集菌体，获得水产品中的总菌及耐受不同浓度、类型抗生素的耐药菌，并提取DNA；(3)PCR扩增并纯化；(4)DGGE电泳和成像；(5)回收目的条带，获取总菌和耐药菌DNA重新扩增并测序；(6)分析测序结果，确定水产品样品中筛选的总菌和耐药菌特异性菌株，判断不同选择条件下水产品样品的菌株及其多样性。2.权利要求1所述快速检测水产品中耐药菌多样性的方法，其特征在于，步骤(1)中，抗生素的浓度梯度范围为EC50值的10％～300％。3.权利要求1所述快速检测水产品中耐药菌多样性的方法，其特征在于，步骤(3)所述PCR扩增的上游引物包含以下序列：5-CCTACGGGAGGCAGCAG-3；并且还含有35-40bp的GC发夹结构；下游引物包含以下序列：5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3；所述PCR扩增的条件为：93～95℃预变性3～7min；93～95℃变性25～35s，64～66℃退火55s～1min，70～73℃延伸50s～1min，16～25个循环；93～95℃变性25～35s，54～56℃退火55s～1min，70～73℃延伸50s～1min，8～12个循环；72℃延伸8～15min。4.权利要求1或3所述快速检测水产品中耐药菌多样性的方法，其特征在于，步骤(3)所述PCR扩增的上游引物序列为5-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCA...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵勇，牛丽，巴永兵，赵飞，刘海泉，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海,31