一种利用Cas9/gRNA系统构建扩增子文库的方法技术方案

本发明专利技术提供了一种利用Cas9/gRNA系统构建扩增子文库的方法。该构建方法包括以下步骤：S1，使用多重PCR技术扩增多个目标区域，得到扩增子；S2，采用Cas9/gRNA系统特异性切除所有扩增子和引物二聚体两侧的通用序列，去除引物二聚体；S3，对扩增子的5’端进行磷酸化修饰，3’端添加“A”，采用连接酶将测序接头分别连接到扩增子的5’端和3’端，磁珠纯化后得到扩增子文库。使用Cas9/gRNA系统消化第1轮反应后的扩增子，能有效去除第1轮反应过程中产生的引物二聚体，提高文库的纯度，增强测序信号的信噪比，同时还可以提高测序数据的均一性，降低文库测序的数据量，降低扩增子文库构建的成本。

【技术实现步骤摘要】
一种利用Cas9/gRNA系统构建扩增子文库的方法
本专利技术属于高通量测序领域，具体而言，本专利技术涉及一种构建扩增子文库的方法。
技术介绍
多重PCR靶向捕获测序技术是指，利用多重PCR技术同时对基因组DNA上的多个目标区域进行扩增，得到扩增子，然后通过酶连接或者通过PCR方式将二代测序接头添加到扩增子序列的两侧，得到扩增子文库，之后进行二代测序，获取目标区域的序列信息。多重PCR靶向捕获技术与液相杂交捕获测序技术相比，具有以下优势：1.灵敏度高、特异性强、文库构建所需样本量低；2.文库构建周期短，一次文库构建的通量高，文库构建的成本低；3.测序深度高，适合对热点区域进行测序分析。基于以上优势，多重PCR靶向捕获测序技术已受到诸多测序公司的重视，基于该技术开发出的测序产品在测序市场上广受欢迎和好评，并且需求量逐年上升。因此，多重PCR靶向捕获技术已经成为靶向测序技术中的重要一员，在推进全民享受低成本，高质量的靶向测序服务的道路上，发挥着越来越重要的作用。尽管多重PCR靶向捕获测序技术的优势明显，但是该技术仍然存在一些不足，这严重制约了该技术的应用。在利用多重PCR技术进行靶向捕获本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用Cas9/gRNA系统构建扩增子的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1：采用多重PCR引物对多个目标区域进行扩增，得到多个扩增子；S2：采用Cas9/gRNA系统对所述扩增子进行消化，特异性切除扩增子和引物二聚体两侧通用序列，去除引物二聚体；S3：依次对所述扩增子进行5’端磷酸化修饰，3’端添加“A”，然后用连接酶将测序接头例如P5和P7连接到扩增子的5’端和3’端；S4：将所述连接后的扩增子磁珠纯化后，得到扩增子文库，然后进行二代测序。

【技术特征摘要】
2016.06.13 CN 20161041256791.一种利用Cas9/gRNA系统构建扩增子的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1：采用多重PCR引物对多个目标区域进行扩增，得到多个扩增子；S2：采用Cas9/gRNA系统对所述扩增子进行消化，特异性切除扩增子和引物二聚体两侧通用序列，去除引物二聚体；S3：依次对所述扩增子进行5’端磷酸化修饰，3’端添加“A”，然后用连接酶将测序接头例如P5和P7连接到扩增子的5’端和3’端；S4：将所述连接后的扩增子磁珠纯化后，得到扩增子文库，然后进行二代测序。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤S1中，所述多重PCR引物的3’端为特异性序列，能够与模板互补配对；所述多重PCR引物的5’端为通用序列。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述多重PCR引物5’端通用序列的长度在24nt以上，且通用序列3’端存在NGG的碱基排列，通用序列能够被Cas9/Grna系统中的gRNA互补配对。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，使用多种不同的通用序列，在S2步骤中加入与之互补配对的gRNA。5.根据权利要求1，其特征在于，所述步骤S2中，采用Cas9蛋白酶，并加入与多重PCR引物5’端通用序列互补配对的gRNA，对扩增子和引物二聚体进...

【专利技术属性】
技术研发人员：易建明，屈武斌，蔡万世，王瑞超，杭兴宜，
申请(专利权)人：艾吉泰康生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11