一种微型化自适应光学双光子荧光成像系统及方法技术方案

本发明专利技术公开了一种微型化自适应光学双光子荧光成像系统及方法，该成像系统包括：激光光源装置，其用于输出激发光；微型探头装置，其用于接收激光光源装置输出的激发光，并产生荧光信号；以及用于根据活体样本内部的组织平面成像视场的各等晕区的平均波前畸变分布，对各等晕区进行波前校正；波前检测装置，其与微型探头装置连接，用于检测平均波前畸变分布；去扫描构件，其用于在波前检测装置检测平均波前畸变分布之前，实时补偿微型探头装置产生的等晕区离轴效应；荧光成像装置，其用于采集微型探头装置输出的荧光信号，完成活体样本内部组织平面的成像。本发明专利技术能够实现具有可在自由活动的动物中进行大视场、高时空分辨率、深层生物组织成像。

Miniaturized adaptive optical two-photon fluorescence imaging system and method

The invention discloses a micro adaptive optics two-photon fluorescence imaging system and method, the imaging system includes a laser light source device, which is used for output luminescence; micro probe device, which is used for receiving the output laser light source device of the excitation light and fluorescence signal; and according to the average distortion distribution of the isoplanatic region in vivo tissue plane imaging field within the sample, the isoplanatic region of wavefront correction; wavefront detection device, and the device is connected with the miniature probe, for the detection of the average distortion distribution; to scan the component, which is used in wavefront detecting device before the average wavefront distortion distribution, real-time compensation device of anisoplanatic miniature probe area of off-axis effect; fluorescence imaging device for miniature probe fluorescence signal acquisition device output, complete the internal living sample Imaging of tissue planes. The invention can realize large field of view, high spatial and temporal resolution and deep biological tissue imaging in freely moving animals.

【技术实现步骤摘要】
一种微型化自适应光学双光子荧光成像系统及方法
本专利技术涉及双光子荧光成像
，特别是涉及一种微型化自适应光学双光子荧光成像系统及方法。
技术介绍
在自由活动的动物中直接记录神经元活动是研究动物行为与神经功能之间的关系最直接有效的方法之一。在之前的很长一段时间里，这一任务都是通过电生理学途径(electrophysiologicalapproach)来执行的。近些年来，光学成像特别是荧光显微技术在这项任务中起了越来越重要的作用。相比于电生理方法，光学成像最大的优势是其具有非侵入性以及更大的成像视野和更多的可观察目标。而与普通的单光子荧光成像技术相比，双光子显微镜具有更好的光学切片能力和更深的穿透深度。这使得双光子显微镜成为利用荧光成像对大脑神经元观察中最重要和最广泛使用的工具。同时，为了观测清醒动物在活动状态下的神经活动，研究者通常会将大型的台式双光子显微镜进行改造，加入一些模拟运动的装置例如跑步机或者转轮等等；但实验时必须将小鼠的头部固定在显微镜镜头之下，仅仅不限制躯干的活动，用这种方式来模拟真实的运动。随着研究的深入，科学家发现这种模拟暴露出许多的弊端。首先，人们认为这种模拟不能反映真实的活动状态。因为动物例如小鼠真实活动中所需要参与的很多过程，例如身体的扭动，周围环境的线索，重力的转换等等在头部固定式都不具备。其次，许多经典的行为学研究，例如恐惧，社交和探索等等无法在头部固定时实现。所以，从2001年开始，人们就开始尝试制造微型的，可以安装在动物头部如大鼠或小鼠头部的，可以在其完全自由活动时进行荧光成像的微型双光子显微镜系统。从2001年美国Denk教授课题组尝试制作的25g小型双光子显微镜到2011年Kerr教授课题组制作的5g微型双光子显微镜。科学家进行了数次尝试，然而都没有达到很理想的效果。总体来讲，由于微型双光子显微镜将所有的光学镜片尺寸都进行了大大的缩减，使得整体的光学质量很难控制。再加上微小的镜头之间的装配和耦合很难跟大型镜片一样好。更重要的是，小型的物镜由于镜片数量的限制，对由样本引入的畸变更加敏感。所有这些问题导致微型化双光子显微镜无法达到跟大型台式双光子显微镜一样的高分辨率成像。这极大的限制了微型化双光子显微镜的推广和应用。另一方面，自适应光学在天文学，眼底检查以及显微成像领域，都被很好的利用，以纠正由系统和样板带来的畸变，进而提高像质。特别是在大型的台式双光子显微镜中，已有人尝试利用自适应光学来纠正像差，提高成像质量。然而，由于常规的自适应光学系统需要复杂的波前检测装置和波前矫正装置，整体体积巨大，是无法应用在微型化双光子显微镜当中的。所以，只有提出新的自适应光学方案，设计新的自适应光学系统，使用新的微型自适应光学器件，才能将自适应光学与微型双光子显微镜结合，进而提高微型化双光子显微镜的成像质量。因此，希望有一种技术方案来克服或至少减轻现有技术的上述缺陷中的至少一个。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种微型化自适应光学双光子成像系统及方法来克服或至少减轻现有技术的上述缺陷中的至少一个。为实现上述目的，本专利技术提供一种微型化自适应光学双光子荧光成像系统，所述微型化自适应光学双光子荧光成像系统包括：激光光源装置，其用于输出激发光；微型探头装置，其用于接收所述激光光源装置输出的激发光，并利用所述激发光激发活体样本内部的组织平面，以产生荧光信号；以及用于在所述活体样本被释放的情形下，根据所述活体样本内部的组织平面成像视场的各等晕区的平均波前畸变分布，对各所述等晕区进行波前校正；波前检测装置，其信号输入端口可操作性地与所述微型探头装置的信号输出端口连接，用于在所述活体样本被固定的情形下，接收所述微型探头装置输出的荧光信号，并检测所述平均波前畸变分布；去扫描构件，其设置在所述微型探头装置与波前检测装置之间的光路上，用于在所述波前检测装置检测所述平均波前畸变分布之前，实时补偿所述微型探头装置产生的等晕区离轴效应；和荧光成像装置，其信号输入端口可操作性地与所述微型探头装置的信号输出端口连接，用于采集所述微型探头装置输出的经由波前校正后的荧光信号，完成所述活体样本内部的组织平面的成像。进一步地，所述微型探头装置包括：激光输入模块，用于接收所述激光光源装置输出的激发光；波前校正模块，用于在所述活体样本被释放的情形下，根据活体样本内部的组织平面成像视场的各等晕区的平均波前畸变分布对各所述等晕区进行波前校正；和扫描成像模块，用于接收波前校正后的激发光，该激发光以二维运动的方式对所述活体样本内部的组织平面进行扫描，以激发所述活体样本产生所述荧光信号。进一步地，所述扫描成像模块包括：第一双轴转镜，其用于通过转动改变激发光入射角角度的方式将由所述波前校正模块波前校正后的激发光对所述活体样本内部的组织平面进行二维扫描；目镜，其用于将来自所述第一双轴转镜的激发光会聚到所述活体样本内部，以激发所述活体样本产生所述荧光信号；以及用于输出所述荧光信号；扫描镜，其布置在所述第一双轴转镜和目镜之间的光路上，用于将所述第一双轴转镜二维扫描所产生的角度变化的激发光转化成位置变化的激发光；和双色镜，其设在所述扫描镜和目镜之间，用于将激发光和荧光信号分开以及输出所述荧光信号。进一步地，所述去扫描构件包括：第二微机电双轴转镜，其设置在所述微型探头装置的信号输出端口和波前检测装置之间的光路上；和第一透镜，其设置在所述第一微机电双轴转镜与所述微型探头装置的信号输出端口之间的光路上，用于接收所述微型探头装置输出的荧光信号，并将所述荧光信号转变成波前以及将该波前的共轭面投射到所述第二微机电双轴转镜上；所述第二微机电双轴转镜以能够实时补偿所述第一微机电双轴转镜扫描产生的等晕区离轴效应的方式与所述第一微机电双轴转镜相配合，再将实时补偿后的激发光传输给所述波前检测装置；所述第二微机电双轴转镜与所述第一微机电双轴转镜之间的配合关系需要满足：在时间上，同频率、同相位；在空间上，扫描角度要求为：所述第二微机电双轴转镜转动的角度与所述第一微机电双轴转镜转动的角度的比值为所述扫描镜的焦距与所述第一透镜的焦距的比值；扫描方向要求为：方向相反。进一步地，所述波前检测装置包括：波前传感器，其用于接收所述第一透镜输出的波前；和第一中继机构，其设置在所述第二微机电双轴转镜与波前传感器之间的光路上，用于使所述第二微机电双轴转镜与波前传感器共轭，使所述波前传感器能够检测到所述平均波前畸变分布。进一步地，所述波前校正模块包括：可变型反射镜，其用于接收所述激光输入模块输出的激发光，并根据所述平均波前畸变分布，改变和控制发射出的激发光的波前；和第二中继机构，其用于使所述可变型反射镜和扫描镜共轭，并将被所述可变型反射镜波前校正后的激发光投射到所述第一双轴转镜的反射面。进一步地，所述波前校正模块还包括设置在光路上的第二透镜、第一半波片、偏振分光立方体、第二半波片和四分之一波片，其中：所述激光输入模块输出的激发光先后经由所述第二透镜和第一半波片，再从所述偏振分光立方体的第一侧面进入所述偏振分光立方体，然后从所述偏振分光立方体的第二侧面输出，并依次通过所述第二半波片和四分之一波片后投射到所述可变型反射镜的反射面；所述可变型反射镜反射出的激发光再次先后通过所述四分之一波本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微型化自适应光学双光子荧光成像系统，其特征在于，包括：激光光源装置(1)，其用于输出激发光；微型探头装置(2)，其用于接收所述激光光源装置(1)输出的激发光，并利用所述激发光激发活体样本内部的组织平面，以产生荧光信号；以及用于在所述活体样本被释放的情形下，根据所述活体样本内部的组织平面成像视场的各等晕区的平均波前畸变分布，对各所述等晕区进行波前校正；波前检测装置(3)，其信号输入端口可操作性地与所述微型探头装置(2)的信号输出端口连接，用于在所述活体样本被固定的情形下，接收所述微型探头装置(2)输出的荧光信号，并检测所述平均波前畸变分布；去扫描构件(4)，其设置在所述微型探头装置(2)与波前检测装置(3)之间的光路上，用于在所述波前检测装置(3)检测所述平均波前畸变分布之前，实时补偿所述微型探头装置(2)产生的等晕区离轴效应；和荧光成像装置(5)，其信号输入端口可操作性地与所述微型探头装置(2)的信号输出端口连接，用于采集所述微型探头装置(2)输出的经由波前校正后的荧光信号，完成所述活体样本内部的组织平面的成像。

【技术特征摘要】
1.一种微型化自适应光学双光子荧光成像系统，其特征在于，包括：激光光源装置(1)，其用于输出激发光；微型探头装置(2)，其用于接收所述激光光源装置(1)输出的激发光，并利用所述激发光激发活体样本内部的组织平面，以产生荧光信号；以及用于在所述活体样本被释放的情形下，根据所述活体样本内部的组织平面成像视场的各等晕区的平均波前畸变分布，对各所述等晕区进行波前校正；波前检测装置(3)，其信号输入端口可操作性地与所述微型探头装置(2)的信号输出端口连接，用于在所述活体样本被固定的情形下，接收所述微型探头装置(2)输出的荧光信号，并检测所述平均波前畸变分布；去扫描构件(4)，其设置在所述微型探头装置(2)与波前检测装置(3)之间的光路上，用于在所述波前检测装置(3)检测所述平均波前畸变分布之前，实时补偿所述微型探头装置(2)产生的等晕区离轴效应；和荧光成像装置(5)，其信号输入端口可操作性地与所述微型探头装置(2)的信号输出端口连接，用于采集所述微型探头装置(2)输出的经由波前校正后的荧光信号，完成所述活体样本内部的组织平面的成像。2.如权利要求1所述的微型化自适应光学双光子荧光成像系统，其特征在于，所述微型探头装置(2)包括：激光输入模块(21)，用于接收所述激光光源装置(1)输出的激发光；波前校正模块(22)，用于在所述活体样本被释放的情形下，根据活体样本内部的组织平面成像视场的各等晕区的平均波前畸变分布对各所述等晕区进行波前校正；和扫描成像模块(23)，用于接收波前校正后的激发光，该激发光以二维运动的方式对所述活体样本内部的组织平面进行扫描，以激发所述活体样本产生所述荧光信号。3.如权利要求2所述的微型化自适应光学双光子荧光成像系统，其特征在于，所述扫描成像模块(23)包括：第一双轴转镜(231)，其用于通过转动改变激发光入射角角度的方式将由所述波前校正模块(22)波前校正后的激发光对所述活体样本内部的组织平面进行二维扫描；目镜(232)，其用于将来自所述第一双轴转镜(231)的激发光会聚到所述活体样本内部，以激发所述活体样本产生所述荧光信号；以及用于输出所述荧光信号；扫描镜(233)，其布置在所述第一双轴转镜(231)和目镜(232)之间的光路上，用于将所述第一双轴转镜(231)二维扫描所产生的角度变化的激发光转化成位置变化的激发光；和双色镜(234)，其设在所述扫描镜(233)和目镜(232)之间，用于将激发光和荧光信号分开以及输出所述荧光信号。4.如权利要求3所述的微型化自适应光学双光子荧光成像系统，其特征在于，所述去扫描构件(4)包括：第二微机电双轴转镜(41)，其设置在所述微型探头装置(2)的信号输出端口和波前检测装置(3)之间的光路上；和第一透镜(42)，其设置在所述第一微机电双轴转镜(31)与所述微型探头装置(2)的信号输出端口之间的光路上，用于接收所述微型探头装置(2)输出的荧光信号，并将所述荧光信号转变成波前以及将该波前的共轭面投射到所述第二微机电双轴转镜(41)上；所述第二微机电双轴转镜(41)以能够实时补偿所述第一微机电双轴转镜(231)扫描产生的等晕区离轴效应的方式与所述第一微机电双轴转镜(231)相配合，再将实时补偿后的激发光传输给所述波前检测装置(3)；所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：宗伟健，程和平，陈良怡，张云峰，王爱民，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11