一种检测菜豆晕疫病菌实时荧光PCR试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术提供了一种用于检测菜豆晕疫病菌Taqman Real‑Time PCR试剂盒及其检测方法，试剂盒包含扩增预混液、荧光校正液、阳性对照、阴性对照、上下游引物、探针、RNase‑free ddH2O。本试剂盒利用特异的扩增引物和Taqman探针，采用Real‑Time PCR技术，通过Ct值对待检样品进行定性分析，结果准确直观，省时省力，检测时间缩短到50分钟；并且比普通PCR的灵敏度高，可用于检测低微含量的菜豆晕疫病菌样品，检测DNA的阈值达到180 fg/μl；试剂耗材成本较低，适用于出入境口岸检疫部门大批量检测业务以及科研院所的检测研究。

Real time fluorescence PCR kit for detection of kidney bean plague pathogen and detection method thereof

The present invention provides a method for detection of bean blight pathogen Taqman Real halo Time PCR reagent kit and detection method, amplification kit comprising premixed liquid, fluorescence correction liquid, positive control, negative control, upstream and downstream primers and probes, RNase free ddH2O. This kit using specific primers and Taqman probe, using Real Time PCR technology, detected samples for qualitative analysis by Ct, the results of accurate and intuitive, time-saving, the detection time is shortened to 50 minutes; and the high sensitivity than ordinary PCR, can be used for pathogen detection in small samples of bean halo. The detection threshold of DNA reached 180 fg/ Mu L; reagent with low cost, suitable for entry and exit quarantine department for business and scientific research institutes of the detection of detection of large quantities of.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物检测领域，具体地说是一种用于检测菜豆晕疫病菌TaqmanReal-TimePCR试剂盒及其检测方法。
技术介绍
菜豆晕疫病菌(Pseudomonassavastanoipv．phaseolicola)是我国的进境植物检疫性有害生物。其寄主范围主要为豆科植物，包括大豆、菜豆、豌豆、绿豆等。由该病菌侵染引起的豆类晕疫病在欧洲、亚洲、美洲、非洲、大洋洲均有发生，可引起豆类作物严重损失，有时甚至绝收。菜豆晕疫病菌主要通过带菌种子作远距离传播，病菌的最适生长温度为25-30℃，中国各豆科作物产区均具备其定殖的条件。此病菌一旦传入我国，必将对我国的大豆产业产生严重影响。近年来，随着国内消费需求的增长，我国进口大豆量呈井喷态势，2016年进口量更是达到8391万吨。国外大豆主产国多数是菜豆晕疫病菌的疫区，因此该病菌随进口豆科植物材料传入我国的风险很大。菜豆晕疫病菌检测方法包括生理生化法、脂肪酸分析法、致病性测试结合玻片凝集试验、酶联免疫法等，但这些常规方法鉴定时间长，灵敏度不高，因此加快对进口豆科作物中携带菜豆晕疫病菌的快速检测技术研究，已成为当前越来越迫切需要解决的问题。TaqManReal-timePCR是在普通PCR方法的基础上，加入了一条荧光标记的探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。利用荧光信号积累，实时监控整个PCR过程，整个过程只需一小时，此外去除了普通分子生物学多种弊端。国内外尚未见检疫性有害生物菜豆晕疫病菌实时荧光方法建立的报道。开发适用于口岸检疫的快速诊断技术对菜豆晕疫病菌进行严格检疫，对防止该类病原菌的传入至关重要。然而，目前权威的检测方法是国家质量监督检验总局发布的中华人民共和国出入境检验检疫行业标准（SN／T1586.2-2008）菜豆晕疫病菌检疫鉴定方法中包括：生理生化指标检测、致病性检测、普通分子方法。其中对可疑菌株进行生化指标的检测必须完成至少四项：接触酶阳性、氧化酶阴性、Ｄ-甘露醇阴性、戊二酸盐阴性排除可疑菌落再进行下一步实验，实验周期长；致病性检测不能单独作为检测方法，常作辅助鉴定手段；普通PCR方法灵敏度一般，并且需要进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳两个步骤，时间至少在3小时，电泳实验中用到的核酸染料污染环境，具有高致癌性，对人体健康有一定影响。此外，对于其它植物病菌，实验室常用的16SrDNA通用引物即可作为常规PCR方法的引物进行PCR扩增测序来鉴定，但是16SrDNA通用引物针对假单胞属下细菌鉴定特异性极差，难以鉴定到种。因此，对于口岸检疫来说，日常进出口检测业务量大，利用普通方法鉴定菌株效果不好，检测效率低，同时，检测周期长会增加进出口商运营成本。为此，本专利技术申请旨在提供一种用于检测菜豆晕疫病菌TaqmanReal-TimePCR试剂盒及其检测方法。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，本专利技术提供了一种用于检测菜豆晕疫病菌TaqmanReal-TimePCR试剂盒及其检测方法，利用特异的扩增引物和Taqman探针，采用Real-TimePCR技术，通过Ct值对待检样品进行菜豆晕疫病菌定性分析。为了达到上述目的，本专利技术采用了如下的技术方案：一种用于检测菜豆晕疫病菌TaqmanReal-TimePCR试剂盒，包括试剂盒主体和如表1所列试剂；其中试剂盒主体包括：盒身，所述盒身中空，内含冷冻液；盒内放置试剂；盒身上方设有盒盖；盒身一侧设有抽屉，抽屉内放置待测样品的DNA。试剂盒一侧还设有带小孔的空腔，空腔与试剂盒内冷冻液采用弹性塑料片隔开，冷冻液凝固时体积膨胀，塑料片向空腔一侧弯曲，缓减膨胀的压力，从而避免试剂盒被胀破。表1试剂盒所含试剂内含试剂规格PCRForwardPrimer2ODPCRReversePrimer2ODTaqmanProbe2OD扩增预混液1mlRNase-freeddH2O1.5ml荧光校正液1ml阳性对照100μl阴性对照100μl优选地，一种用于检测菜豆晕疫病菌TaqmanReal-TimePCR试剂盒中PCRForwardPrimer序列为：5’-GTGGGTACATCTGGAATC-3’；以菜豆晕疫病菌argK基因为模板设计得到。优选地，一种用于检测菜豆晕疫病菌TaqmanReal-TimePCR试剂盒中PCRReversePrimer序列为：5’-CTGACATCCTCCGTATTG-3’；以菜豆晕疫病菌argK基因为模板设计得到。优选地，一种用于检测菜豆晕疫病菌TaqmanReal-TimePCR试剂盒中TaqmanProbe序列为：5’-(FAM)ATCACCGTCGCACCATACGA(TAMRA)-3’；以菜豆晕疫病菌argK基因为模板设计得到。优选地，一种用于检测菜豆晕疫病菌TaqmanReal-TimePCR试剂盒中扩增预混液包括：DNA聚合酶、2×PCR缓冲液（500mM/LKCl、100mM/LTris-HCl、150mM/LMgCl2、1mg/ml明胶）、dNTP贮备液、RNaseH。优选地，一种用于检测菜豆晕疫病菌TaqmanReal-TimePCR试剂盒中荧光校正液包括：ROX荧光染料。优选地，一种用于检测菜豆晕疫病菌TaqmanReal-TimePCR试剂盒中阳性对照采用菜豆晕疫病菌标准菌株所提取纯化的DNA。优选地，一种用于检测菜豆晕疫病菌TaqmanReal-TimePCR试剂盒中阴性对照采用健康大豆种子提取纯化DNA。优选地，一种用于检测菜豆晕疫病菌TaqmanReal-TimePCR试剂盒采用-20℃保存，密闭保存，防止污染。一种用于检测菜豆晕疫病菌TaqmanReal-TimePCR检测方法，包括如下操作步骤：1、探针及引物稀释；2、配置PCR反应液；3、进行Real-timePCR反应；4、实验结果分析。优选地，一种用于检测菜豆晕疫病菌TaqmanReal-TimePCR检测方法，其中步骤1探针及引物稀释包括：探针和引物在开盖前离心5min，然后根据nmol数，使用RNase-freeddH2O配制成浓度为XμMOligo溶液。配制浓度为XμMOligo溶液加入RNase-freeddH2O体积：V(ml)=nmol数/X优选地，一种用于检测菜豆晕疫病菌TaqmanReal-TimePCR检测方法，其中步骤2配置PCR反应液时按表2所述方法配制：表2PCR反应液的配制方法试剂使用量扩增预混液10μlPCRForwardPrimer(10μM)0.4μlPCRReversePrimer(10μM)0.4μlTaqmanProbe0.2μlRNase-freeddH2O6.6μlDNA2μl荧光校正液0.4μlTotal20μl优选地，一种用于检测菜豆晕疫病菌TaqmanReal-TimePCR检测方法，其中步骤3进行Real-timePCR反应时两步法PCR扩增标准程序，具体包括本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测菜豆晕疫病菌Taqman Real‑Time PCR试剂盒，其特征在于，试剂盒包括试剂盒主体和试剂；其中试剂盒主体包括：盒身，所述盒身中空，内含冷冻液，盒内放置试剂，盒身上方设有盒盖，盒身一侧设有抽屉，抽屉内放置待测样品的DNA；试剂包括：PCR Forward Primer、PCR Reverse Primer、Taqman Probe、扩增预混液、RNase‑free ddH2O、荧光校正液、阳性对照和阴性对照；试剂盒一侧还设有带小孔的空腔，空腔与试剂盒内冷冻液采用弹性塑料片隔开。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测菜豆晕疫病菌TaqmanReal-TimePCR试剂盒，其特征在于，试剂盒包括试剂盒主体和试剂；其中试剂盒主体包括：盒身，所述盒身中空，内含冷冻液，盒内放置试剂，盒身上方设有盒盖，盒身一侧设有抽屉，抽屉内放置待测样品的DNA；试剂包括：PCRForwardPrimer、PCRReversePrimer、TaqmanProbe、扩增预混液、RNase-freeddH2O、荧光校正液、阳性对照和阴性对照；试剂盒一侧还设有带小孔的空腔，空腔与试剂盒内冷冻液采用弹性塑料片隔开。2.根据权利要求1所述的一种用于检测菜豆晕疫病菌TaqmanReal-TimePCR试剂盒，其特征在于，所述PCRForwardPrimer序列为：5’-GTGGGTACATCTGGAATC-3’。3.根据权利要求1所述的一种用于检测菜豆晕疫病菌TaqmanReal-TimePCR试剂盒，其特征在于，所述PCRReversePrimer序列为：5’-CTGACATCCTCCGTATTG-3’。4.根据权利要求1所述的一种用于检测菜豆晕疫病菌TaqmanReal-TimePCR试剂盒，其特征在于，所述TaqmanProbe序列为：5’-(FAM)ATCACCGTCGCACCATACGA(TAMRA)-3’。5.一种用于检测菜豆晕疫病菌TaqmanReal-TimePCR检测方法，其特征在于，该方法包括：（1）探针及引物稀释；（2）配置PCR反应液；（3）进行Real-timePCR反应；（4）实验结果分析。6.根据权利要求5所述的一种用于检测菜豆晕疫病菌TaqmanReal-TimePCR检测方法，其特征在于，步骤1探针及引物稀释包括：探针和引物在开盖前离心5min，然后根据nmol数，使用RNase-freeddH2O配制成浓度为XμMOligo溶液；配制浓度为XμMOlig...

【专利技术属性】
技术研发人员：尤佳，王溪桥，王军平，文朝慧，满岳，周小平，
申请(专利权)人：甘肃出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心，
类型：发明
国别省市：甘肃;62