向跨膜孔输送分析物的方法技术

技术编号:15917487 阅读:22 留言:0更新日期:2017-08-02 02:53
本发明专利技术涉及向膜中的跨膜孔输送分析物的新方法。所述方法涉及微粒的使用。

Method for delivering analytes to transmembrane pores

The present invention relates to a new method for delivering analytes to a transmembrane hole in a membrane. The method relates to the use of particles.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】向跨膜孔输送分析物的方法
本专利技术涉及向膜中的跨膜孔输送分析物的新方法。所述方法涉及微粒的使用。
技术介绍
目前需要一种具有广泛的应用范围的快速且便宜的多核苷酸(例如,DNA或RNA)测序和识别技术。现有技术缓慢且昂贵,主要是因为其依赖于扩增技术来制备大量的多核苷酸,并且需要大量专门的荧光化学品用于信号检测。作为聚合物和各种小分子的直接电生物传感器,跨膜孔(纳米孔)具有巨大潜力。特别是作为潜在的DNA测序技术,纳米孔最近受到关注。当跨纳米孔施加电势时,分析物如核苷酸在桶中短暂停留一段时间时,会产生电流的变化。对核苷酸进行纳米孔检测产生已知特征和持续时间的电流变化。在“链测序”方法中,单个多核苷酸链穿过所述孔并实现对核苷酸的鉴定。链测序可涉及使用多核苷酸结合蛋白来控制多核苷酸穿过所述孔的移动。之前已经证明,通过将分析物的偶联到存在相关检测器的膜可以实现超低浓度分析物的输送。这样可以将进行检测所需的分析物的量降低几个数量级(WO2012/164270)。
技术实现思路
专利技术人已经出乎意料地证明可以使用微粒来提高向膜中的跨膜孔输送分析物的效率。所述微粒使得利用跨膜孔进行检测所需的分析物的量降低了几个数量级。因此,本专利技术提供一种向膜中的跨膜孔输送分析物的方法,包括(a)提供连接到微粒的分析物;和(b)将所述微粒输送向所述膜,并由此向所述跨膜孔输送所述分析物。本专利技术还提供:-一种表征多核苷酸分析物的方法,包括(a)在多核苷酸分析物上实施本专利技术的所述方法;(b)使多核苷酸与跨膜孔相互作用,使得所述多核苷酸移动穿过所述孔;和(c)随着所述多核苷酸相对于所述孔移动,获取一个或多个测量值,其中,所述测量值代表所述多核苷酸的一个或多个特征,并由此表征所述多核苷酸;-一种使用跨膜孔确定存在分析物、不存在分析物或分析物的一个或多个特征的方法,包括(a)实施本专利技术的所述方法;(b)使所述分析物与跨膜孔相互作用;和(c)在所述相互作用期间获取一个或多个测量值,其中,所述测量值代表存在所述分析物、不存在所述分析物或所述分析物的一个或多个特征;和-一种向膜中的跨膜孔输送分析物的试剂盒,包括(a)微粒和(b)一个或多个能够将所述分析物偶联到所述膜的锚定体。附图说明图1示出了如何将DNA与实施例1中的连接的卡通示意图(未按比例)。双链DNA(dsDNA)样本通过λDNA的片段化获得(以虚线表示,标记为A),并具有与λDNA的任一端连接的Y-适配器(标记为B)和发夹适配器(标记为C)。两种不同的解旋酶与dsDNA样本结合。与Y-适配器结合的解旋酶(标记为D)在其氨基酸序列中不存在组氨酸标签(6个连续的组氨酸),而与发夹结合的解旋酶(标记为E)在其氨基酸序列中存在组氨酸标签(6个连续的组氨酸;在图中显示为灰色正方形并标记为F)。当组氨酸标签隔离和下拉式的(His-TagIsolationandPulldown)(标记为G)与dsDNA样本预孵育时,该珠粒表面上的钴(以黑色圆圈表示,标记为H)此时与酶上的组氨酸结合。dsDNA样本还具有两个锚定体(标记为J),其连接到与所述样本杂交的DNA链(标记为I),这些锚定体用于将DNA连接到膜。该图示出了单个dsDNA样本的连接,然而珠粒被钴覆盖,因此非常有可能在单个珠粒上结合多个dsDNA样本。图2示出了当DNA文库样本与预孵育(通道4-7)或不与预孵育(通道1-3)时所观察到的通量(每小时测序的兆碱基DNA)标准化成最大通量的柱状图。y-轴标记=标准化成最大值的通量,x-轴标记=运行次数。图3示出了在一添加DNA/珠粒样本后的纳米孔芯片系统的明视场图像(Brightfieldimage)。在形成膜的芯片区域(该区域由黑色圆圈突出显示在其中一个凹槽上)上观察到少量(被视为小的暗点)。图4示出了在添加DNA/珠粒样本20分钟后纳米孔芯片系统的明视场图像。在形成膜的芯片区域(该区域由黑色圆圈突出显示在其中一个凹槽上)上观察到大簇的(在图中用白色虚线圆圈突出显示)。图5示出了在添加各种之前(点X)和之后(点Y)饱和通道的数量图(y-轴)。被研究的不同的官能团是1-硅烷,2-链霉亲和素和与短的生物素化DNA链结合的3-链霉亲和素。图6示出了向纳米孔系统中添加不同珠粒(1-硅烷,2-链霉亲和素,与短的生物素化DNA链结合的3-链霉亲和素;隔离和下拉式4-钴基组氨酸标签)时不再活动(标记为X的柱)的单通道MspA纳米孔的百分比(y-轴)和饱和通道(标记为Y的柱)的百分比。图7示出了在存在链霉亲和素包被的珠粒(标记为2)的情况下或不存在链霉亲和素包被的珠粒(标记为0)的情况下孔数量(y-轴)相对于开孔电流(x-轴,pA)的示意图。图8A示出了阵列芯片上单个凹槽的侧面的卡通示意图。由TOK光致抗蚀剂制成的支柱标记为A,凹槽的侧面标记为B,凹槽内和凹槽上的缓冲液标记为D并显示为深灰色,膜(两亲层)标记为E并用黑线显示,F表示包被在DNA中的微粒。该图示出了微粒沉积在油层的边缘上,然后微粒沿着油层的边缘滚动并收集在膜的顶部。图8B示出了阵列芯片中同一单凹槽的俯视图和侧视图(10倍放大)。向缓冲溶液中添加荧光团,并向预处理液(油)中添加不同颜色的荧光团,以说明这些溶液存在在系统中的哪些地方。这些图像说明图8A中以卡通形式示出的系统在阵列芯片中制备,因为这些图像是使用共焦显微镜拍摄的图像。图9示出了如何输送DNA样本(A)到磁性微粒上、检测并随后在输送第二DNA样本(B)到磁性微粒上之前从纳米孔移去DNA样本(A)、检测第二DNA样本(B)并随后从纳米孔移去的卡通示意图。(A)表示没有添加磁性微粒的系统。(B)表示使用磁性微粒输送样本A。(C)表示来自样本A的信息的充分数据收集。(D)表示从系统中移去微粒(其在样本A中进行包被),这通过将磁珠暴露于磁体来完成,所述磁体通过从膜中移去磁性微粒来使样本A从膜中解偶联。(E)表示系统现在没有样本A。(F)表示使用磁性微粒输送第二样本B。(G)表示来自样本B的信息的充分数据收集。(H)表示从系统中移去微粒(其在样本B中进行包被),这通过将磁珠暴露于磁体来完成,所述磁体通过从膜中移去磁性微粒来使样本B从膜中解偶联。为了输送、检测并且然后移去大量样本,可以重复上述过程。图10示出了DNA如何与实施例5中的连接的卡通示意图(未按比例)。双链DNA(dsDNA)样本通过λDNA的片段化获得(以虚线表示,标记为A),并具有与λDNA的任一端连接的Y-适配器(标记为B)和发夹适配器(标记为C)。与Y-适配器结合的解旋酶标记为D。示出了与发夹适配器杂交的寡核苷酸(标记为E)并含有生物素部分(标记为F)。当MyOneC1(标记为G)与dsDNA样本预孵育时,珠粒表面上的链霉亲和素(显示为黑色圆圈并标记为H)将与生物素结合。dsDNA样本还具有附加的锚定体(标记为J),其连接到与Y-适配器杂交的DNA链(标记为I)上,该锚定体用于将DNA连接到膜。该图示出了单个dsDNA样本的连接,然而珠粒被链霉亲和素覆盖,因此极有可能在单个珠粒上结合多个dsDNA样本。图11示出了样本A和B在实施例6所描述的实验期间的覆盖深度的两个图(y-轴=覆盖深度,x-轴=样本1(见标记为1的区域)和2(见标记为2的本文档来自技高网...
向跨膜孔输送分析物的方法

【技术保护点】
一种向膜中的跨膜孔输送分析物的方法,包括:(a)提供连接到微粒的分析物;和(b)将所述微粒输送给所述膜,并由此向所述跨膜孔输送所述分析物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.17 GB 1418469.11.一种向膜中的跨膜孔输送分析物的方法,包括:(a)提供连接到微粒的分析物;和(b)将所述微粒输送给所述膜,并由此向所述跨膜孔输送所述分析物。2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述方法用于向膜中的跨膜孔输送浓度增加的分析物。3.根据权利要求1或3所述的方法,其中,所述方法是通过向所述跨膜孔输送浓度增加的分析物来采用膜中的跨膜孔对分析物进行表征的改进方法。4.根据权利要求2或3所述的方法,其中,输送给所述跨膜孔的分析物的浓度优选增加至少约10倍。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,步骤(b)包括设置所述微粒靠近或邻近所述膜并使所述微粒向所述膜移动。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述方法包括(a)使所述微粒沿着电化学梯度、扩散梯度、亲水梯度或疏水梯度移动;(b)使所述微粒在磁场内移动;(c)使所述微粒在电场内移动;(d)使所述微粒在压力下移动;或(e)使所述微粒随重力移动。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述分析物暂时连接到所述微粒。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、30个或更多个、50个或更多个、100个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个、5,000个或更多个、10,000个或更多个、100,000个或更多个、1,000,000个或更多个或者5,000,000个或更多个分析物连接到所述微粒。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述分析物包含一个或多个能够偶联到所述膜的锚定体。10.根据权利要求9所述的方法,其中,所述方法还包括使用所述一个或多个锚定体将所述分析物偶联到所述膜。11.根据权利要求9或10所述的方法,其中,所述一个或多个锚定体包含多肽锚定体和/或疏水锚定体。12.根据权利要求11所述的方法,其中,所述疏水锚定体包含脂质、脂肪酸、固醇、碳纳米管或氨基酸。13.根据权利要求9至12中任一项所述的方法,其中,所述一个或多个锚定体包含连接体。14.根据权利要求9至12中任一项所述的方法,其中,所述分析物暂时偶联到所述膜。15.根据权利要求7或14所述的方法,其中,所述分析物通过杂交连接到所述微粒和/或所述一个或多个锚定体通过杂交连接到所述分析物。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述膜是两亲层或固态层。17.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述微粒由陶瓷、玻璃、二氧化硅、聚合物或金属形成。18.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述微粒直径为500μm或更小。19.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述微粒是磁性的。20.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述跨膜孔是跨膜蛋白孔。21.根据权利要求20所述的方法,其中,所述跨膜蛋白孔衍生自耻垢分枝杆菌孔蛋白(Msp)、α-溶血素(α-HL)或胞溶素。22.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述分析物是聚合物。23.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述分析物是多核苷酸。24.根据权利要求23所述的方法,其中,所述方法用于向膜中的跨膜孔输送浓度增加的多核苷酸。25.根据权利要求22或23所述的方法,其中,所述方法是通过向所述跨膜孔输送浓度增加的多核苷酸来采用膜中的跨膜孔对所述多核苷酸进行表征或测序的改进方法。26.一种表征多核苷酸的方法,包括(a)实施根据权利要求23至25中任一项所述的方法;(b)使多核苷酸与跨膜孔相互作用,使得所述多核苷酸移动穿过所述孔;和(c)随着所述...

【专利技术属性】
技术研发人员:克莱夫·布朗丹尼尔·赖安·加拉尔达安迪·赫伦丹尼尔·约翰·特纳詹姆斯·怀特
申请(专利权)人:牛津纳米孔技术公司
类型:发明
国别省市:英国,GB

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