一种利用高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌降解石油的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌降解石油的方法，包括如下步骤：(1)高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌的获得；(2)扩大培养：将步骤(1)获得的铜绿假单胞菌接种到液体培养基中培养，摇床培养条件为30±1℃，150‑180rpm，培养50‑60小时，离心，过滤，收集菌丝体，干燥后获得菌粉；(3)降解石油：针对海洋石油污染，向石油污染海面投放步骤(2)获得的菌粉，菌粉投放量以处理每100克石油投放20‑30克菌粉计，自然降解15‑30天。本发明专利技术降解迅速、无残毒、成本低。

Method for degrading petroleum by using high yield rhamnolipid and Pseudomonas aeruginosa

The invention discloses a method for using high rhamnolipid production by Pseudomonas aeruginosa degradation of oil, which comprises the following steps: (1) to obtain high yield of Pseudomonas aeruginosa rhamnolipid; (2) expand the steps of culture: (1) the cultured Pseudomonas aeruginosa was cultured in liquid medium. Shaking culture condition was 30 + 1 C, 150 180rpm, 50 cultured 60 hours, centrifugation, filtration, collecting mycelium, dried fungus powder; (3) the degradation of petroleum: for marine oil pollution, oil pollution on the steps to the sea (2) fungus powder obtained by bacteria powder quantity to treatment every 100 grams 30 grams of oil on the 20 fungus powder, natural degradation of 15 30 days. The present invention degraded rapidly, no residue, low cost.

【技术实现步骤摘要】
一种利用高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌降解石油的方法
本专利技术涉及海洋污染处理
，特别涉及一种利用高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌降解石油的方法。
技术介绍
石油污染经常与石油工业事故，坦克及管道运输，石油储存罐泄露等有关，据统计每年至少有400000吨的原油泄露到海洋环境中。除了这些海事事故造成的石油泄露以外，海上油田的开发也是一个重要的污染源。随着全球经济的增长，全球贸易日趋激烈，海上运输也会越来越频繁，海上事故也将越来越多，海上石油污染必将愈演愈烈。利用生物的方法来修复石油污染环境近些年来越来越受关注，因为这种方法迅速、无残毒、低成本。目前最常用的生物方法是人工培育和改良嗜油微生物，将这些微生物投入到污染的海洋环境中，进行石油烃类降解，以达到生物修复的目的。微生物通过生产生物表面活性剂来降解石油，但是由于微生物底物价格高，下游加工工序成本昂贵，产量低等原因，将微生物用于工业化生产生物表面活性剂的范例较少。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌降解石油的方法，降解迅速、无残毒、成本低。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种利用高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌降解石油的方法，包括如下步骤：(1)高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌的获得：从舟山海域油泥污染区域取来油污泥样品，通过富集培养，筛选出具有乳化活性的菌株，对筛选出的具有乳化活性的菌株进行16SrDNAPCR，并对PCR产物进行测序，并将测序结果与NCBI数据库进行比对，对菌株进行鉴定，确定为铜绿假单胞菌；(2)扩大培养：将步骤(1)获得的铜绿假单胞菌接种到液体培养基中培养，摇床培养条件为30±1℃，150-180rpm，培养50-60小时，离心，过滤，收集菌丝体，干燥后获得菌粉；(3)降解石油：针对海洋石油污染，向石油污染海面投放步骤(2)获得的菌粉，菌粉投放量以处理每100克石油投放20-30克菌粉计，自然降解15-30天。作为优选，高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌的获得的具体步骤为：A、取0.1g舟山海域的油污泥溶解于1L基础培养基中，30℃、180rpm转速下摇床培养3天后得液体菌种，取1mL液体菌种接种到1L液体培养基中，30℃、180rpm转速下摇床培养50小时获得菌液；B、将菌液涂布到固体培养基上，30℃培养12h，随机挑选7个菌落分别接种到1L液体培养基中，30℃、180rpm转速下摇床培养50小时，收集菌液并提取细菌基因组DNA；C、以提取的细菌基因组DNA为模板，分别进行16SrDNAPCR扩增，采用的引物为：正向引物为27F，反向引物为1492R，其中27F的5’端有FAM荧光标记；D、将16SrDNAPCR产物使用HhaⅠ限制性内切酶进行酶切，37℃金属浴恒温过夜，酶切产物利用微型垂直PAGE凝胶电泳分离，最后通过荧光成像系统观察凝胶，各样本出现同样条带，确定为同一种菌；E、对16SrDNAPCR产物进行测序，并将测序结果与NCBI数据库进行比对，对菌株进行鉴定确定为铜绿假单胞菌。本专利技术通过RFLP的方法对优势菌进行检测和筛选，简单，成本低廉，高效快速，因此能够大大节约实验成本和时间，获得高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌。作为优选，基础培养基配方为：Na2HPO40.6g/L，KH2PO40.2g/L，NaNO34.0g/L，MgSO40.3g/L，CaCl20.01g/L，FeSO40.01g/L，水余量。作为优选，液体培养基配方为：葡萄糖20-40g/L，Na2HPO40.6g/L，KH2PO40.2g/L，NaNO34.0g/L，MgSO40.3g/L，CaCl20.01g/L，FeSO40.01g/L，水余量。作为优选，固体培养基配方为：葡萄糖20-40g/L，琼脂15g/L，Na2HPO40.6g/L，KH2PO40.2g/L，NaNO34.0g/L，MgSO40.3g/L，CaCl20.01g/L，FeSO40.01g/L，水余量。作为优选，27F的核苷酸序列为：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，M为A或C；1492R的核苷酸序列为：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’，Y为C或T。作为优选，步骤C的PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，循环40次；最后72℃延伸10min。作为优选，步骤D中，微型垂直PAGE凝胶电泳的电泳缓冲液为TBE，电泳条件为100v恒压，2h。作为优选，步骤D中，微型垂直PAGE凝胶电泳的电泳凝胶配方为：蒸馏水5.5mL，30％Acr-Bis(30％为Acr-Bis(质量比为29:1)的混合物质量浓度)25mL，1M的pH8.8Tris19mL，10％过硫酸铵(10％质量浓度)0.5mL，TEMED0.02mL。本专利技术的有益效果是：筛选获得的铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂，对石油的降解效果好，降解迅速、无残毒、成本低。附图说明图1是乳化活性微生物的分离，图中：(A)细胞生长和表面张力测定。(B)微生物种群的RFLP模式变化。(C)挑取7个菌落进行RFLP鉴定。(D)7个菌落培养后的表面张力检测。图2是ZS1进化树。图3是排油圈和乳化指数(E24)；排油圈：a.MSM+YE培养菌液滴入原油中排油圈，b.MSM+Glu培养菌液滴入原油中排油圈；乳化指数(E24)：c.3ml蒸馏水与3ml原油，d.3mlMSM+Glu培养菌液与3ml原油，e.3mlMSM+YE培养菌液与3ml原油。MSM+Glu即液体培养基：葡萄糖20g/L，Na2HPO40.6g/L，KH2PO40.2g/L，NaNO34.0g/L，MgSO40.3g/L，CaCl20.01g/L，FeSO40.01g/L，水余量。MSM+YE配方为：酵母粉20g/L，Na2HPO40.6g/L，KH2PO40.2g/L，NaNO34.0g/L，MgSO40.3g/L，CaCl20.01g/L，FeSO40.01g/L，水余量。图4是鼠李糖脂-排油圈标准曲线图5ZS1在不同葡萄糖浓度条件下生产鼠李糖脂的情况。(A)分离株ZS1在不同葡萄糖浓度下生长的情况。(B)分离株ZS1在不同葡萄糖浓度下生产鼠李糖脂的情况。(C)在不同葡萄糖浓度下ZS1的鼠李糖脂生产的碳源得率。(D)在不同葡萄糖浓度下ZS1的鼠李糖脂生产率。图6分离株ZS1在添加轻原油或十六烷为唯一碳源的基础培养基中的生长情况。(A)在含1％轻原油基础培养基中的生长情况。黑实线和灰实线分别示意轻原油总量(％)和细胞质量；虚线示意乳化的轻原油。(B)培养液中原油从挂壁到完全悬浮的现象。时间与(A)一致。(C)分离株ZS1在添加2％十六烷的基础培养基中生长情况。图示与(A)一致。具体实施方式下面通过具体实施例，对本专利技术的技术方案作进一步的具体说明。本专利技术中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。实施例：一、铜绿假单胞菌ZS1的筛选与鉴定1.取0.1g舟山海域的油污泥溶解于1L基础培养基中，30℃、180rpm转速下摇床培养3天后得液体菌种，取1mL液体菌种接种到1L液体培养基中，30℃、180rpm转本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌降解石油的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌的获得：从舟山海域油泥污染区域取来油污泥样品，通过富集培养，筛选出具有乳化活性的菌株，对筛选出的具有乳化活性的菌株进行16S rDNA PCR，并对PCR产物进行测序，并将测序结果与NCBI数据库进行比对，对菌株进行鉴定，确定为铜绿假单胞菌；(2)扩大培养：将步骤(1)获得的铜绿假单胞菌接种到液体培养基中培养，摇床培养条件为30±1℃，150‑180rpm，培养50‑60小时，离心，过滤，收集菌丝体，干燥后获得菌粉；(3)降解石油：针对海洋石油污染，向石油污染海面投放步骤(2)获得的菌粉，菌粉投放量以处理每100克石油投放20‑30克菌粉计，自然降解15‑30天。

【技术特征摘要】
1.一种利用高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌降解石油的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌的获得：从舟山海域油泥污染区域取来油污泥样品，通过富集培养，筛选出具有乳化活性的菌株，对筛选出的具有乳化活性的菌株进行16SrDNAPCR，并对PCR产物进行测序，并将测序结果与NCBI数据库进行比对，对菌株进行鉴定，确定为铜绿假单胞菌；(2)扩大培养：将步骤(1)获得的铜绿假单胞菌接种到液体培养基中培养，摇床培养条件为30±1℃，150-180rpm，培养50-60小时，离心，过滤，收集菌丝体，干燥后获得菌粉；(3)降解石油：针对海洋石油污染，向石油污染海面投放步骤(2)获得的菌粉，菌粉投放量以处理每100克石油投放20-30克菌粉计，自然降解15-30天。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌的获得的具体步骤为：A、取0.1g舟山海域的油污泥溶解于1L基础培养基中，30℃、180rpm转速下摇床培养3天后得液体菌种，取1mL液体菌种接种到1L液体培养基中，30℃、180rpm转速下摇床培养50小时获得菌液；B、将菌液涂布到固体培养基上，30℃培养12h，随机挑选7个菌落分别接种到1L液体培养基中，30℃、180rpm转速下摇床培养50小时，收集菌液并提取细菌基因组DNA；C、以提取的细菌基因组DNA为模板，分别进行16SrDNAPCR扩增，采用的引物为：正向引物为27F，反向引物为1492R，其中27F的5’端有FAM荧光标记；D、将16SrDNAPCR产物使用HhaⅠ限制性内切酶进行酶切，37℃金属浴恒温过夜，酶切产物利用微型垂直PAGE凝胶电泳分离，最后通过荧光成像系统观察凝胶，各样本出现同样条带，确定为同一种菌；E、对16SrDNAPCR产物进行测序，并将测序结果与NC...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘建华，何靖，程涛，梁冀北，胡兴翠，
申请(专利权)人：浙江大学舟山海洋研究中心，
类型：发明
国别省市：浙江,33