一个太子参环肽HB前体蛋白基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开一个太子参环肽HB前体蛋白基因PhHB的序列、克隆方法及其应用。该基因核苷酸序列长477bp，其中，编码区(CDS)为108bp(编码35个氨基酸)，含有172bp的5′非编码区(5′UTR)及197bp的3′非编码区(3′UTR)。该基因具有典型的植物环肽前体蛋白基因的结构，蛋白序列中含有的太子参环肽HB线性肽prePhHB(IFGGLPPP)经人工合成后，通过环化反应可以生成太子参环肽HB。这一发明专利技术为基于太子参环肽HB前体蛋白基因表达水平的应用，以及采用生物技术或化学技术合成太子参环肽HB，提供科学依据。

A cyclic peptides pseudostellarins HB precursor protein gene and its application

The invention discloses a method for cloning and sequence of a cyclic peptides pseudostellarins HB precursor protein gene PhHB and its application. The nucleotide sequence of the gene is long 477bp, in which the coding region (CDS) is 108BP (encoding 35 amino acids), containing 172bp 5 'noncoding region (5' UTR) and 197bp '3' noncoding region (3 'UTR). This gene has the typical structure of plant peptide precursor protein gene, cyclic peptides pseudostellarins HB linear peptide prePhHB containing protein in the sequence (IFGGLPPP) by artificial synthesis, through cyclization reaction can generate cyclic peptides pseudostellarins HB. This invention is a cyclic peptides pseudostellarins HB precursor protein gene expression level based on the application and use of biotechnology or chemical synthesis of Pseudostellaria ring peptide HB, provide a scientific basis for.

【技术实现步骤摘要】
一个太子参环肽HB前体蛋白基因及其应用
：本专利技术属于中药材功能基因
具体涉及一个太子参环肽HB前体蛋白基因及其编码的多肽的应用。技术背景：中药太子参为石竹科植物孩儿参Pseudostellariaheterophylla(Miq.)Pax的干燥块根，具有益气健脾、生津润肺的功效。太子参因药性温和，为药食两用中药材。随着太子参在保健食品、化妆品产业用量的逐年增多，市场需求量增大，刺激了太子参种植产业的迅速扩大。以贵州省为例，十余个县市行政区拟以发展太子参种植作为改善农业产业结构和推动地方经济发展的手段之一。目前已从太子参中分离得到约16种环肽类成分，其广泛的生理活性是医药领域研究的新热点。现代研究表明，太子参环肽类成分具有酪氨酸酶抑制活性，有抗皮肤黑色素生成的作用，与将太子参作为保健药品、化妆品进行研制开发的定位理念相得宜彰，尤其太子参环肽HB(HeterophyllinB，HB)曾被《中国药典》(2005年版、2010年版)收录为太子参含量测定的成分。现代研究证明，植物环肽的生物合成路径主要由三部分组成：环肽前体蛋白基因转录并表达成环肽前体蛋白，经蛋白酶剪切生成线性肽，在环化酶的作用下生成环肽蛋白。其中，环肽前体蛋白基因的转录和表达是合成的第一步，也是关键步骤。本专利技术为基于太子参环肽HB前体蛋白基因的应用，如太子参中太子参环肽HB前体蛋白基因表达水平的检测，以及采用生物技术或化学技术合成太子参环肽HB等方面奠定了坚实的基础。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于提供太子参环肽HB前体蛋白基因PhHB的核苷酸序列、太子参环肽HB前体蛋白基因PhHB的CDS序列、太子参环肽HB前体蛋白基因PhHB编码的氨基酸序列、太子参环肽HB线性肽prePhHB的氨基酸序列、太子参环肽HB前体蛋白基因PhHBCDS序列全长的扩增引物，太子参环肽HB前体蛋白基因PhHB表达水平的检测引物，以及在此序列基础上进行密码子优化或点突变所产生的与原始序列相似度90％以上的序列。本专利技术所述的太子参环肽HB前体蛋白基因PhHB(如序列表中SEQIDNo.1所示)，其特征在于，太子参环肽HB前体蛋白基因PhHB序列的应用。该基因的核苷酸序列长477bp，含有172bp的5′非编码区(5′UTR)及197bp的3′非编码区(3′UTR)，其中，CDS为108bp，编码35个氨基酸。该基因具有典型的植物环肽前体蛋白基因的结构。本专利技术所述的太子参环肽HB前体蛋白基因PhHB克隆方法，其特征在于，以SEQIDNo.1序列设计引物，以太子参cDNA为模板扩增太子参环肽HB前体蛋白基因PhHB的全长CDS，连接转化后，挑选阳性克隆。本专利技术提供了太子参环肽HB线性肽prePhHB的应用，如：根据本专利技术提供的基因的氨基酸序列，合成太子参环肽HB线性肽prePhHB，进而采用生物技术或化学技术合成太子参环肽HB。本专利技术提供太子参环肽HB前体蛋白基因PhHB的核苷酸序列在太子参相关研究中的应用，如：根据基因序列设计特异引物，通过PCR技术检测和分析太子参环肽HB前体蛋白基因在不同太子参材料中的表达水平。专利技术人进行了一系列实验，以探明本专利技术提供的太子参环肽HB前体蛋白基因PhHB及其编码的多肽，通过实验验证prePhHB为太子参环肽HB的线性肽，以说明本专利技术的有效性。具体如下：一、构建太子参转录组数据库提取太子参的总RNA，利用第二代高通量测序技术，通过IlluminaHiSeq2500测序平台进行转录组测序，对测序数据进行富集、拼接、注释，构建太子参转录组数据库。二、分析太子参转录组数据库使用muscle3.6、BioEdit、Genetyx_version7等多款生物信息软件综合分析太子参的转录组数据库，得到一条基因序列(其序列如序列表中SEQIDNo.1所示)，本专利技术将其命名为PhHB。所述PhHB基因具有典型的植物环肽前体蛋白基因结构，其编码的氨基酸序列中包含太子参环肽HB的线性肽(本专利技术命名为prePhHB，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.4所示)，因此，推测PhHB基因为太子参环肽HB的前体蛋白基因。三、验证(1)扩增PhHB的全长CDS根据PhHB的核苷酸序列(如序列表中SEQIDNo.1所示)信息，设计全长CDS扩增引物(其上、下游引物序列分别如序列表中SEQIDNo.5、SEQIDNo.6所示)。以太子参块根cDNA第一链为模板，通过PCR扩增及克隆测序，所得核苷酸序列与序列表中SEQIDNo.2完全一致，说明前述扩增引物可以扩增太子参环肽HB前体蛋白基因PhHB的全长CDS。(2)太子参环肽HB环化反应以化学方法合成的线性肽prePhHB(氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.4所示)为底物，经缓冲液(pH＝8.5)提取的太子参块根粗酶催化可生成环肽HB，说明prePhHB是形成太子参环肽HB的前体蛋白。(3)太子参PhHB基因表达分析太子参材料可分为太子参环肽HB含量较高、较低两类。根据太子参环肽HB前体蛋白基因PhHB设计特异引物(其上、下游引物序列分别如序列表中SEQIDNo.7、SEQIDNo.8所示)，以不同HeterophyllinB含量的太子参的块根cDNA第一链为模板，分别进行PCR反应。以2.0％的琼脂糖凝胶电泳后条带的明暗程度判定PhHB基因的表达水平。结果说明PhHB的表达量与太子参中环肽HB的含量呈正相关，结合前述(1)、(2)的验证结果，进一步说明PhHB是形成太子参环肽HB的前体蛋白基因。附图说明：图1为太子参环肽HB的化学分子结构式。图2为太子参环肽HB前体基因PhHB全长CDS扩增电泳检测图谱；M：Marker(TaKaRaDL500)；1～2：太子参环肽HB前体基因。图3为太子参环肽HB标准品的HPLC图谱。图4为环化反应的太子参环肽HB的HPLC图谱；CK－：环化反应中未加粗酶。图5为环化反应的太子参环肽HB的HPLC图谱；CK+环化反应中未加prePhHB。图6为环化反应的太子参环肽HB的HPLC图谱；环化反应中同时加prePhHB和粗酶。图7为环化反应的太子参环肽HB量比较柱形图；K－：环化反应中未加粗酶；CK+环化反应中未加prePhHB；prePhHB：同时加线性肽prePhHB和粗酶。100：环化反应中加入粗酶的量为100μL；150：环化反应中加入粗酶的量为150μL；200：环化反应中加入粗酶的量为200μL。图8为不同太子参环肽HB含量的太子参材料中PhHB前体基因表达的电泳检测图谱；M：Marker(TaKaRaDL500)；1～6：太子参环肽HB含量高的太子参；7～12：太子参环肽HB含量极低的太子参。具体实施方式：以下结合实施例子来进一步解释本专利技术，以使本领域普通技术人员参阅本说明书后能够据以实施，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。实施例一：以贵州施秉太子参块根为材料，提取总RNA，以反转录cDNA的第一链作为模板，进行PCR扩增反应。25μL反应体系，包括：0.125μLTaKaRaExTaq(5U·μL-1)，2.5μL10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus)，2μLdNTPMixture(各2.5mmol·L-1)，本文档来自技高网...

【技术保护点】
太子参环肽HB前体蛋白基因PhHB及其应用，其特征在于，太子参环肽HB前体蛋白基因PhHB的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示，所述基因的编码区(CDS)为108bp，序列如序列表中SEQ ID No.2所示，所述CDS编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示；其特征在于，太子参环肽HB线性肽prePhHB氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示。

【技术特征摘要】
1.太子参环肽HB前体蛋白基因PhHB及其应用，其特征在于，太子参环肽HB前体蛋白基因PhHB的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.1所示，所述基因的编码区(CDS)为108bp，序列如序列表中SEQIDNo.2所示，所述CDS编码的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.3所示；其特征在于，太子参环肽HB线性肽prePhHB氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.4所示。2.太子参环肽HB前体蛋白基因PhHB的应用，其特征在于，太子参环肽HB前体蛋白基因PhHB的克隆方法，以SEQIDNo.1序列设计全长CDS扩增引物，以太子参cDNA为模板，扩增太子参环肽HB前体蛋白基因PhHB全长CDS，连接转化后，挑取阳...

【专利技术属性】
技术研发人员：周涛，江维克，郑伟，李军，赵丹，丁铃，龙登凯，
申请(专利权)人：贵阳中医学院，
类型：发明
国别省市：贵州,52