基因沉默指示基因及其病毒诱导沉默载体以及构建和侵染方法技术

本发明专利技术公开了一种用于TRV介导的基因沉默系统中的指示基因，其核酸序列如SEQ ID No:1所示，还公开了含有该序列的病毒诱导沉默载体及其构建方法，并利用该沉默载体侵染柑橘幼苗的方法。本发明专利技术为TRV介导的病毒诱导基因沉默体系提供有效的指示基因，是首次在柑橘中成功建立TRV介导的病毒沉默系统，成功地沉默了柑橘中的指示基因。利用本发明专利技术的沉默载体构建的沉默系统操作简单、转化效率高、能够快速地在柑橘中对基因进行功能验证。能够有效地抑制柑橘中的内源基因表达，表型显著。本发明专利技术提供的沉默载体为快速、有效地在柑橘中进行基因功能验证提供了可靠技术。

Gene silence indicating gene and its viral induced silencing vector, construction and infection method

The invention discloses a system for gene silencing mediated by TRV gene in the nucleic acid sequence of instructions, such as SEQ ID No:1 shows, comprising the sequence of virus induced silencing vector and its construction method, and use the method of the silencing vector infection of citrus seedlings. The invention provides an effective indicator gene for TRV mediated virus induced gene silencing system, and successfully establishes a TRV mediated viral silencing system in Citrus for the first time, and successfully silences the indicator genes in citrus. The silencing system constructed by the silencing vector of the invention has simple operation and high conversion efficiency, and can rapidly carry out functional verification of the genes in the citrus. It can effectively inhibit the expression of endogenous genes in citrus, and the phenotype is remarkable. The silencing vector provided by the invention provides a reliable technique for rapidly and effectively performing gene function verification in citrus.

【技术实现步骤摘要】
基因沉默指示基因及其病毒诱导沉默载体以及构建和侵染方法
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种基因沉默指示基因及其病毒诱导沉默载体以及构建和侵染方法。
技术介绍
柑橘属于多年生木本植物，通过常规的遗传转化技术验证基因功能，一直受到遗传转化率低、再生周期长和童期长等困扰。病毒诱导的基因沉默(virus-inducedgenesilencing，VIGS)是一个抑制内源基因表达的强大工具，因其具有快速、高效、高通量、便利、便宜等优点，已被用于如马铃薯(Solanumtuberosum)、本生烟(Nicotianabenthamiana)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、西红柿、水稻(Oryzasativa)和玉米(Zeamays)等多种植物的基因功能研究。目前，多个VIGS载体被应用于解析代谢途径、植物发育、生物和非生物胁迫。近年来，多种VIGS载体相继得到开发并在多种植物中得到广泛的应用。其中，烟草脆裂病毒(TRV)是目前应用最广泛的VIGS载体，它是由TRV1与TRV2两条RNA病毒链组成，TRV1用于辅助载有靶基因片段的TRV2在植物体内移动。TRV作为病毒载体有诸多优点，比如病毒症状较轻、沉默效率高且持久、各种组织均可产生沉默等，因而被广泛应用。虽然，来源于柑橘的叶疱斑病毒(citrusleafblotchvirus，CLBV)和衰退病病毒(citrustristezavirus，CTV)的载体已在柑橘中建立沉默体系，但存在基因沉默表型出现慢、不是很稳定，未被应用于更广泛的基因功能研究。TRV是很多草本和少数木本植物中广泛应用于鉴定基因功能的VIGS载体。在这些寄主植物中，TRV引起的症状比其它载体相对温和，并且能够快速地传递到分生组织、根、果实、花和叶等整个植株，甚至通过种子传到子代。然而，TRV载体是否能够有效地抑制柑橘中的内源基因表达，目前尚未见报道。MagnesiumchelatasesubunitI(CHll)基因是控制叶绿素的生物合成相关的基因，在一些植物中被作为一个通用的VIGS报告基因，沉默此基因导致叶片形成黄化现象。目前柑橘的CHll基因目前还未得到证实和报道。
技术实现思路
针对以上问题，本专利技术一方面提供一种用于TRV介导的基因沉默系统中的指示基因，其核酸序列如SEQIDNo:1所示。本专利技术另一方面提供了一种含有柑橘CHll指示基因的病毒诱导沉默载体，所述载体为TRV介导的柑橘CHll基因病毒诱导沉默载体，其含有如SEQIDNo:1所示的核苷酸序列。本专利技术另一方面还提供了一种上述含有柑橘CHll指示基因的病毒诱导沉默载体的构建方法，包括如下步骤：(1)提取柑橘植株cDNA；(2)以柑橘植株cDNA为模板，以引物CiCHll-V2-F和CiCHll-V2-R进行PCR扩增，引物序列为：CiCHll-V2-F：5’-TCTAGAGGTCTGTGGGACGATTGACAT-3’，CiCHll-V2-R：5’-GAGCTCCGAGCTCTCTCCTCCACAATC-3’；(3)将步骤(2)的扩增产物进行回收纯化得到目的基因片段；(4)用XbaI和SacI限制性内切酶分别对TRV2载体和步骤(3)得到的目的基因片段进行双酶切；(5)将步骤(4)得到的目的基因片段和TRV2载体的酶切产物进行连接；(6)将连接产物转化至DH5α感受态细胞，筛选得到阳性克隆，提取质粒，即得。在上述技术方案中，所述步骤(2)中的PCR反应程序为：98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环。本专利技术另一方面还提供了一种重组载体侵染柑橘幼苗的方法，包括如下步骤：(1)将上述制备得到的病毒诱导沉默载体进行扩繁得到扩繁菌液，与TRV1的扩繁菌液混合，得到侵染液；(2)将柑橘幼苗浸入侵染液，在真空条件下进行浸染10s～30min，或采用无菌注射器将重悬液注射叶片；(3)用清水冲洗浸染的部位后，将幼苗移至光照培养箱中培养，培养条件为19～28℃，白天光照14～18h，夜间黑暗培养6～10h，保持50～95％的湿度进行培养。本专利技术另一方面还提供了一种用于如SEQIDNo:1所示指示基因的实时荧光定量检测的引物组，所述引物组的上、下游序列为：CiCHll-qPCR-F：5’-AGATCCAGAGGCCATGGGTAT-3’，CiCHll-qPCR-R：5’-ATCGTCCCACAGACCCTGTCT-3’。本专利技术的有益效果是：本专利技术首次成功证实了柑橘的CHll基因，并利用TRV成功构建了沉默柑橘CHll基因的诱导载体，首次证明TRV能够成功应用于柑橘基因沉默和功能验证，为柑橘类植物的基因功能研究奠定了很好的基础。本专利技术的基因沉默载体构建简易，沉默表型显著，性状表现持久，为快速的基因功能研究起到良好的指示作用。附图说明图1是TRV2-CiCHll和TRV1混合的重悬液侵染柑橘幼苗后的荧光观察图。图2是处理组浸染的柑橘幼苗的DNA常规PCR扩增产物电泳图，V1：TRV1部分片段，V2：TRV2部分片段，G：GFP部分片段，M：DL2000marker。图3是墨西哥莱檬和长寿金柑用对照组和处理组进行侵染后14天时的植株叶片表型图，MXGLM：墨西哥莱檬，CSK：长寿金柑，C+：对照组，CHll-TRV：处理组。图4是长寿金柑侵染后14天CHll基因qRT-PCR表达量检测结果图，CHll-TRV：处理组，TRV+：对照组，TRV-：未进行侵染的植株。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。主要试剂及生产者：PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit、T4DNALigase、Ex：TaKaRa公司，日本。BioSpinGelExtractionKit：杭州博日科技有限公司，中国。限制性内切酶XbaI、SacI：ThermoScientific公司，美国。TRV1、TRV2-GFP、TRV2载体：中国农业科学院柑桔研究所资源育种研究室保存提供。DH5α感受态细胞：TaKaRa公司，日本。EHA105农杆菌感受态细胞：中国农业科学院柑桔研究所资源育种研究室保存提供。E.Z.N.A.TMPlasmidMiniKitI：OMEGAbio-tek公司，美国。总RNA提取试剂盒：天根公司，中国。实施例1柑橘CHll基因病毒诱导沉默载体的构建1、提取柑橘叶片cDNA：用cDNA提取试剂盒PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit提取柑橘叶片cDNA。2、扩增柑橘CHll基因从拟南芥基因组数据库搜寻到CHll的氨基酸序列，通过与柑橘的基因组数据库(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)进行Blast比对后获得同源基因序列，根据该同源基因设计带有酶切位点的柑橘CHll基因的PCR扩增引物CiCHll-V2-F和CiCHll-V2-R，引物序列为：CiCHll-V2-F：5’-TCTAGAGGTCTGTGGGACGATTGACAT-3’(SEQIDNo:2)，CiCHll-V2-R：5’-GAGCTCCGAGCTCTCTCCTCCACAATC-3’(SEQIDNo本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于TRV介导的基因沉默系统中的指示基因，其特征在于，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。

【技术特征摘要】
1.用于TRV介导的基因沉默系统中的指示基因，其特征在于，其核酸序列如SEQIDNo:1所示。2.一种含有柑橘CHll指示基因的病毒诱导沉默载体，其特征在于，所述载体为TRV介导的柑橘CHll基因病毒诱导沉默载体，其含有如SEQIDNo:1所示的核苷酸序列。3.一种如权利要求2所述的含有柑橘CHll指示基因的病毒诱导沉默载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取柑橘植株cDNA；(2)以柑橘植株cDNA为模板，以引物CiCHll-V2-F和CiCHll-V2-R进行PCR扩增，引物序列为：CiCHll-V2-F：5’-TCTAGAGGTCTGTGGGACGATTGACAT-3’，CiCHll-V2-R：5’-GAGCTCCGAGCTCTCTCCTCCACAATC-3’；(3)将步骤(2)的扩增产物进行回收纯化得到目的基因片段；(4)用XbaI和SacI限制性内切酶分别对TRV2载体和步骤(3)得到的目的基因片段进行双酶切；(5)将步骤(4)得到的目的基因片段和TRV2载体的酶切产物进行连接；(6)将连接产物转化至...

【专利技术属性】
技术研发人员：王福生，赵晓春，申晚霞，刘小丰，朱世平，
申请(专利权)人：中国农业科学院柑桔研究所，
类型：发明
国别省市：重庆,50