盐生草抗旱基因Hg.S4及其应用制造技术

本发明专利技术涉及盐生草抗旱基因Hg.S4及其应用，属于植物生物工程技术领域。本发明专利技术首次从盐生植物盐生草中克隆到抗旱基因Hg.S4，该基因cDNA的核苷酸序列见SEQ ID NO.1，分子量为619bp，其cDNA编码序列为SEQ ID NO.1中第228至第341位所述的核苷酸序列，分子量为114bp，氨基酸序列见SEQ ID NO.3，由37个氨基酸组成。盐生草抗旱基因Hg.S4基因能够显著提高转基因拟南芥的抗旱性。本发明专利技术所述的抗旱基因将促进于抗旱作物和植物新品种(系)的培育进程。

Salt grass drought resistant gene Hg.S4 and application thereof

The present invention relates to drought resistant gene Hg.S4 of halophyte and its application, belonging to the field of plant biological engineering technology. The invention for the first time from the halophyte salt was cloned into Hg.S4 grass drought resistance gene, nucleotide sequence of the gene cDNA SEQ ID NO.1, molecular weight of 619bp, cDNA sequences encoding the nucleotide sequence of 228Th to 341st of the SEQ ID NO.1, molecular weight is 114bp. The amino acid sequence. SEQ ID NO.3, consisting of 37 amino acids. The drought resistant gene Hg.S4 of halophyte could significantly improve drought resistance of transgenic Arabidopsis thaliana. The drought resistant gene of the invention will promote the breeding process of drought resistant crops and new plant varieties (lines).

【技术实现步骤摘要】
盐生草抗旱基因Hg.S4及其应用
本专利技术属于植物生物工程和转基因
，具体涉及盐生植物盐生草抗旱基因Hg.S4及其应用。
技术介绍
随着世界人口的持续增加和经济的快速发展，水资源短缺问题日趋严重，尤其是近年来全球气候变暖不断加剧，更是导致了干旱地区的迅速扩大和干旱化程度加重。在全球农业生产中，干旱胁迫已成为造成作物减产的最主要非生物胁迫，同样在我国，干旱造成的粮食损失占全部自然灾害的50％以上，尤其是北方旱作农业区，解决干旱问题是实现农业可持续发展的重要挑战。由于传统作物抗旱育种周期长、投入大且受抗旱种质资源狭窄等因素的制约，使得当前抗旱育种进展缓慢。当前迅速发展的生物技术育种，尤其是转基因技术打破了物种间限制，为高效抗旱育种提供了新的途径，但抗旱基因资源的获得是抗旱转基因作物新品种的关键。我国西北旱区生长的盐生植物盐生草(Halogetonglomeratus)，具有抗旱、耐盐的双重特性，是挖掘抗旱基因的优异材料，从中克隆的抗旱基因在植物抗旱育种中更具有重要价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种盐生草抗旱基因Hg.S4，以解决当前抗旱基因资源匮乏的现状。本专利技术的又一目的在于提供一种盐生草抗旱基因Hg.S4的制备方法，实现该基因在盐生草中的快速、准确分离。本专利技术最后一目的在于提供盐生草抗旱基因Hg.S4在提高植物抗旱性中的应用。依据前期盐生草盐胁迫响应转录组学测序结果(Transcriptomicprofilingofthesalt-stressresponseinthehalophyteHalogetonglomeratus[J].BMCgenomics,2015,16(1):169)，鉴定到盐胁迫诱导表达基因HgS4，申请人以盐生草叶片为材料，分离出HgS4基因，将该基因构建表达载体，转化到拟南芥后，可显著提高植株的耐旱能力。利用本专利技术所述基因，构建各种植物表达载体，可广泛应用于转基因植物和作物抗旱新品种的培育。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种盐生草抗旱基因Hg.S4，其主要特点在于从盐生草叶片中分离到Hg.S4基因cDNA的核苷酸序列SEQIDNO.1如下，分子量为619bp；所述的盐生草抗旱基因Hg.S4的编码序列为上述Hg.S4基因cDNA的核苷酸序列中第228至第341位所述的核苷酸序列SEQIDNO.2如下，分子量为114bp：所述的盐生草抗旱基因Hg.S4的编码序列编码的蛋白质氨基酸序列SEQIDNO.3，由37个氨基酸组成：所述的盐生草抗旱基因HgS4，其特异引物为：HgS4-F15’-ACCCCCATACTCTCGTAACCCTATA-3’HgS4-R15’-AGTCGAAACATACTTCCCATTAAAG-3’。由上海生工生物工程公司合成。所述的盐生草抗旱基因Hg.S4的制备方法，其主要特点在于步骤为：以200-500mMNaCl胁迫处理3-7d盐生草幼苗的叶片为材料，Trizol法提取总RNA，采用cDNA合成试剂盒(大连宝生物工程有限公司)，反转录合成cDNA第一链，扩增该基因片段，PCR反应体系为dNTPMixture2.5mM2ul，10×ExTaqBufferMg2+Plus2.5ul，上游引物5’-ACCCCCATACTCTCGTAACCCTATA-3’10μM1ul，下游引物5’-AGTCGAAACATACTTCCCATTAAAG-3’10μM1ul，cDNA1ul，ExTaq酶5U/ul0.2ul，ddH2O17.3ul，总体积25ul；扩增程序为94℃4min，94℃50s，59.0-59.5℃30s，72℃25s，共32-35个循环，72℃延伸8min；利用胶回收试剂盒(大连宝生物工程有限公司；GelExtractionMiniKit)回收PCR产物，接着将回收产物与pMD19-T(大连宝生物工程有限公司)载体连接，得到重组质粒pMD19-HgS4，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选蓝白斑并测序。PCR测定序列如SEQIDNO.1。所述的盐生草抗旱基因HgS4表达载体的构建方法，其步骤为：在所述的盐生草抗旱基因HgS4的上下游引物上分别添加KpnI和BamHI这两个酶切位点，上游引物F1为5’-GGGGTACCACCCCCATACTCTCGTAACCCTATA-3’、下游引物R1为5’-CGGGATCCAGTCGAAACATACTTCCCATTAAAG-3’；以200-500mMNaCl胁迫处理3-7d盐生草幼苗的叶片为材料，Trizol法提取总RNA，采用cDNA合成是试剂盒(大连宝生物工程有限公司生产)反转录合成cDNA第一链，扩增该基因片段，PCR反应体系为dNTPMixture(2.5mM)2ul，10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus)_2.5ul，上游引物5’-GGGGTACCACCCCCATACTCTCGTAACCCTATA-3’10μM1ul，下游引物5’-CGGGATCCAGTCGAAACATACTTCCCATTAAAG-3’10μM1ul，cDNA1ul，ExTaq酶(5U/ul)0.2ul，ddH2O17.3ul，总体积25ul。扩增程序为94℃4min，94℃50s，59.0-59.5℃30s，72℃25s，共32-35个循环，72℃延伸8min。PCR扩增产物电泳如图1所示，按照说明书步骤，利用胶回收试剂盒(大连宝生物工程有限公司；GelExtractionMiniKit)回收PCR产物，接着将回收产物与pMD19-T(大连宝生物工程有限公司)载体连接，得到重组质粒pMD19-HgS4，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选蓝白斑并测序，PCR测定序列如SEQIDNO.1：对HgS4再次进行PCR扩增，并连接到T-载体测序，测序结果同SEQIDNO.1。提取含有HgS4基因的T-载体和植物表达载体pCAMBIA3301质粒DNA并用KpnI和BamHI两种内切酶对所提质粒进行双酶切，酶切体系KpnI1ul，BamHI1ul，10×T3ul，BSA2ul，质粒DNA4ul，ddH2O9ul，总体积20μL在37℃酶切2-2.5h，并对酶切产物进行纯化。接着用T4DNA连接酶，对纯化回收的载体及目的片段进行连接，连接体系为10×T4DNALigase1ul，目的片段HgS4基因7ul，载体pCAMBIA3301(甘肃农业大学干旱生境作物学重点实验室保存)DNA1ul，总体积9μL。在65℃水浴保温3min，即可冰浴1-2min，然后加T4DNALigase1ul于16℃连接12-16h。将链接好的重组质粒pCAMBIA3301-HgS4转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选蓝白斑并测序。同时对重组质粒在37℃酶切2-2.5h，其双酶切体系KpnI1μL，BamHI1μL，10×T2μL，BSA2μL，质粒DNA6μL，ddH2O8μL，总体积20μL。并对双酶切产物进行电泳检测。所述的盐生草抗旱基因Hg.S4在提高植物抗旱性中的应用。本专利技术中重组质粒pCAMBIA3301-HgS4，所述质粒为插入SEQIDNO.1所示的HgS4基因cDNA的核苷酸序列或cDNA编码序列。同样，任何可以将外本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种盐生草抗旱基因Hg.S4，其特征在于从盐生草叶片中分离到Hg.S4基因cDNA的核苷酸序列如下，分子量为619bp；

【技术特征摘要】
1.一种盐生草抗旱基因Hg.S4，其特征在于从盐生草叶片中分离到Hg.S4基因cDNA的核苷酸序列如下，分子量为619bp；2.如权利要求1所述的盐生草抗旱基因Hg.S4，其特征在于所述的盐生草抗旱基因Hg.S4的编码序列为权利要求1中第228位至第341位，所述的核苷酸序列如下，分子量为114bp：。3.如权利要求2所述的盐生草抗旱基因Hg.S4，其特征在于所述的盐生草抗旱基因Hg.S4的编码序列的蛋白质氨基酸序列，由37个氨基酸组成：4.如权利要求1所述的盐生草抗旱基因HgS4，其特征在于特异引物为：HgS4-F15’-ACCCCCATACTCTCGTAACCCTATA-3’HgS4-R15’-AGTCGAAACATACTTCCCATTAAAG-3’。5.如权利要求1所述的盐生草抗旱基因Hg.S4的制备方法，其特征在于步骤为：以200-500mMNaCl胁迫处理3-7d盐生草幼苗的叶片为材料，Trizol法提取总RNA，采用cDNA合成试剂盒，反转录合成cDNA第一链，扩增该基因片段，PCR反应体系为dNTPMixture2.5mM2ul，10×ExTaqBufferMg2+Plus2.5ul，上游引物5’-ACCCCCATACTCTCGTAACCCTATA-3’10μM1ul，下游引物5’-AGTCGAAACATACTTCCCATTAAAG-3’10μM1ul，cDNA1ul，ExTaq酶5U/ul0.2ul，ddH2O17.3ul，总体积25ul；扩增程序为94℃4min，94℃50s，59.0-59.5℃30s，72℃25s，共32-35个循环，72℃延伸7-8min；利用胶回收试剂盒回收PCR产物，接着将回收产物与pMD19-T载体连接，得到重组质粒pMD19-HgS4，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选蓝白斑并测序。6.如权利要求1所述的盐生草抗旱基因HgS4表达载体的构建方法，其特征在于步骤为：在所述的盐生草抗旱基因HgS4的上下游引物上分别添加KpnI和BamHI这两个酶切位点，上游引物F1为5’-GGGGTACCACCCCCATACTCTCGTAACCCTATA-3’、下游引物R1为5’-CGGGATCCAGTCGAAACATACT...

【专利技术属性】
技术研发人员：王化俊，汪军成，姚立蓉，李葆春，孟亚雄，马小乐，杨轲，任盼荣，司二静，邹兰，张燕，闫栋，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62