一种肺癌监测试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术提供一种肺癌监测试剂盒及其使用方法。该试剂盒包括：试剂A：浓度为10mM的碳酸氢铵溶液中加入5%的SDS配制而成；试剂B：浓度为3.3% NP40中加入不少于2.2单位/μL 糖苷外切酶配制而成；试剂C：等体积20mM APTS的1.2M 柠檬酸和 1M有机物还原剂的DMSO的混合液；试剂D：0.25μL浓度为100mM、pH 5的NH

Lung cancer monitoring kit and method of use thereof

The invention provides a lung cancer monitoring kit and a method for using the same. The kit includes: A reagent was added at a concentration of 5% ammonium bicarbonate solution in 10mM SDS prepared; B: reagent concentration of 3.3% NP40 added less than 2.2 units / L exoglycosidase prepared; reagent C: mixture volume 20mM APTS 1.2M citric acid 1M and organic agent DMSO; reagent D:0.25 L concentration of 100mM, pH 5 NH

【技术实现步骤摘要】
一种肺癌监测试剂盒及其使用方法
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种肺癌监测试剂盒及其使用方法。
技术介绍
在世界范围内，无论男性还是女性，肺癌均已成为癌症死亡的主要原因。2005年估计中国肺癌的新发病例大约有500,000例（男性约330,000例，女性约170,000例），2007年美国肺癌的新发病例估计有213,380例，死亡160,390例在世界范围内。肺癌高死亡率的主要原因有二个：一是肺癌缺乏有效的早期诊断手段，70%以上的病人在确诊时已属晚期；二是晚期肺癌（尤其是非小细胞肺癌，NSCLC）对化疗的敏感性差，现有的各种化疗方案对NSCLC的总体有效率仅为30%左右。肺癌按解剖学部分分类可分为2类：中央型肺癌和周围型肺癌。中央型肺癌发生于肺段或肺段以上的支气管,主要为磷状上皮癌、小细胞癌、大细胞癌及类癌。周围型肺癌发生于肺段以下的支气管，见于各种组织学类型。其基本大体病理形态为肺内结节或肿块。肺癌组织病理学分类为两种基本类型，第一种是非小细胞型肺癌，另外一种是小细胞肺癌。肺癌的诊断目前主要通过以下几种方法，胸部影像学检查是诊断肿瘤最重要的方法之一，对早期诊断肺癌有重要意义。支气管镜除能直接观察病变形态特征及支气管狭窄情况外，还能通过经支气管镜肺活检、经纤支镜针吸细胞学检查（TBNA）等直接选取组织进行病理检查，提高肺癌的诊断率，并对肺癌(尤其是NSCLC)分期具有重要指导作用。支气管内超声检查（EBUS）是在支气管镜引导下，通过超声探头对支气管腔内、气管及周围组织进行检查与治疗的方法。自动荧光支气管镜（AFB）是利用细胞自发性荧光和电脑图像分析技术开发的新型纤维支气管镜，可明显提高气管镜对肺癌及癌前病变早期诊断的敏感性。电磁导航支气管镜（ENB）结合传统支气管镜与螺旋CT仿真支气管镜的优点，可提高常规支气管镜对周围肺病灶的阳性检出率。光干涉断层扫描（OCT）是将红外线分为两束光，一束直接照射，另一束经过反射再照射，两束光重叠产生光干涉现象，检测各层光反射的强弱和时间延迟，并经计算机处理，即得出与B型超声、CT类似的二次断层图像,其获得的反射图像高于以往任何方法的分辨率和敏感性。痰脱落细胞检查是诊断肺癌的重要手段，如痰标本收集方法得当，连续3次以上痰标本检查可提高中央型肺癌诊断率达80%，周围型肺癌诊断率达50%。肿瘤标志物检测方法简单、创伤小、可重复性好，是临床筛选及早期诊断肿瘤的首选方法，其在机体特定部位的表达对肿瘤的诊断相对特异。诊断肺癌常用的肿瘤标志物有癌胚抗原(CEA)、神经元特异烯醇化酶(NSE)、细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、CA-125、肺癌相关抗原、血管内皮生长因子、增生细胞核抗原、表皮生长因子受体等。糖蛋白分子由多肽链和糖两部分组成。血清糖蛋白中任何变化可以反映人体的生理改变。近年来的糖组学研究也显示了寡糖链的改变与各种肿瘤的发生和发展有密切的相关性（参考文献：Liu，X-E，Desmyter，L，Gao，C-F，Laroy，W，Dewaele，S，Vanhooren，V，Wang，L，Zhuang，H，Callewaert，N，Libert，C，Contreras，R，Chen，C.N-GlycomicchangesinhepatocellμLarcarcinomapatientswithlivercirrhosisinducedbyhepatitisBvirus.Hepatology，46，1426-1435，2007.）。鉴于肺癌监测的不确定性，目前迫切需要一种能有效监测肺癌的试剂盒和监测评估方法。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术的目的是解决现有检测方法对肺癌监测的不确定，提供一种肺癌监测试剂盒及其使用方法，通过检测血液糖蛋白的N-糖苷键连接的碳水化合物（N-寡糖）含量的改变来评估肺癌的进展以及愈后肿瘤的复发。技术方案：一种肺癌监测试剂盒，由以下试剂组成：试剂A：浓度为10mM的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度5%的SDS配制而成；试剂B：质量浓度浓度为不低于3.3%NP40中加入不少于2.2单位/μL糖苷外切酶配制而成；试剂C：等体积20mMAPTS的1.2M柠檬酸和1M有机物还原剂的DMSO的混合液；试剂D：不低于0.25μL浓度为100mM的NH4AC，不少于0.2μL的唾液酸酶，2.55μL双氧水。其中，所述有机物还原剂为NaCNBH3。其中，试剂A的体积可以为2μL，试剂B的体积可以为4μL，试剂C的体积可以为2μL，试剂D的体积可以为2μL。上述肺癌监测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：步骤1，往稀释一倍的4μL血清加入2μL的试剂A，进行变性反应，加入4μL试剂B，37℃反应3小时后干燥，得到样品；步骤2，在所得样品中加入2μL试剂C，进行荧光标记，然后加入200μL水终止标记反应，得到荧光标记后的样品；步骤3，将2μL试剂D加至2μL荧光标记后的样品，进行去末端唾液酸反应，加入200μL的水终止标记反应，得到去末端唾液酸反应的样品；步骤4，取10μL去末端唾液酸反应的样品，用ABI测序仪进行寡糖链片分离，得到图谱。进一步地，步骤1变性反应的条件为不低于95℃加热。进一步地，步骤2中荧光标记的条件为60-70℃加热。进一步地，步骤3中去末端唾液酸反应的条件为不高于45℃加热。以上所述的肺癌监测试剂盒可以用于检测包含有寡糖链成分的血液或所有人体体液。有益效果：本专利技术的肺癌监测试剂盒基于检测血液糖蛋白中寡糖链的指纹图谱作为诊断指标对肺癌患者进行了评估，以诊断肺癌的肿瘤分期。该检测方法可以让众多肺癌患者接受常规、无创检测，帮助医生检测肺癌，并能够及时监测疾病进展。附图说明图1为实施例1中采用血清的N-寡糖链指纹技术分析的流程示意图；图2为实施例1中采用的人血清G-Test图谱；图3为实施例1中健康对照组的血清G-Test图谱；图4为实施例1中肺癌患者的血清G-Test图谱。具体实施方式下面将进一步的详细说明本专利技术。需要指出的是，以下说明仅仅是对本专利技术要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本专利技术的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。研究发现，血液糖蛋白的糖苷键连接的碳水化合物含量的改变与肺癌患者的组织学之间存在显著地相关性。进一步地，评估肺癌临床监测方法可有效筛查、定期评估肺癌的进展以及治疗后肿瘤的复发。在本专利技术中，采用血清的寡糖链指纹技术（简称G-Test方法）作为诊断指标对肺癌患者进行了评估。该方法主要步骤是，释放并荧光标记血清或血浆样品中的糖蛋白的寡糖链；分离测量样本中荧光标记的寡糖链的含量或指纹图谱（简称G-Test图谱）；分析比较寡糖指纹图谱，得到检测指标参数，具体流程见图1。该方法可以让众多肺癌患者接受常规、无创检测，帮助医生检测肺癌，并能够及时监测疾病的发生和发病的进展。具体地，用于监测患肺癌或肺癌风险的组合物选自下述的寡糖链：NA3F、NA2F、NA2FB、NGA2F、NGA2FB以及NA3。以下实施例中，利用(NA3F+NA2FB)/NA3的比值来诊断肺癌检测。如图2所示，人血清的G-Test图谱大概显示出近10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肺癌监测试剂盒，其特征在于：由以下试剂组成：试剂A：浓度为10mM的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度5%的SDS配制而成；试剂B：质量浓度浓度为不低于3.3% NP40中加入不少于2.2单位/μL 糖苷外切酶配制而成；试剂C：等体积20mM APTS的1.2M柠檬酸和1M有机物还原剂的DMSO的混合液；试剂D：不低于0.25μL浓度为100mM的NH

【技术特征摘要】
1.一种肺癌监测试剂盒，其特征在于：由以下试剂组成：试剂A：浓度为10mM的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度5%的SDS配制而成；试剂B：质量浓度浓度为不低于3.3%NP40中加入不少于2.2单位/μL糖苷外切酶配制而成；试剂C：等体积20mMAPTS的1.2M柠檬酸和1M有机物还原剂的DMSO的混合液；试剂D：不低于0.25μL浓度为100mM的NH4AC，不少于0.2μL的唾液酸酶，2.55μL双氧水。2.根据权利要求1所述的肺癌监测试剂盒，其特征在于：所述有机物还原剂为NaCNBH3。3.权利要求1所述的肺癌监测试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1，往稀释一倍的4μL血清加入2μL的试剂A，进行变性反应，加入4μL试剂B，37℃反应3小时后干燥，得到样品；步骤2，在所得样品中加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈翠英，
申请(专利权)人：先思达南京生物科技有限公司，江苏先思达生物科技有限公司，常州吉泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32