The invention discloses a detection, RNA enzyme modified H nucleic acid amplification and specifically relates to a RNA enzyme H contains DNA polymerase and can be induced by the hot start enzyme composition, the enzyme composition for hot start in PCR detection in samples of target DNA (DNA) sequence of application. The inducible RNA enzyme H can be reversibly improved by using CIS maleic anhydride or formaldehyde, and the RNA enzyme H activity of the inducible RNA enzyme H is induced at a temperature of 90 DEG C or higher.
【技术实现步骤摘要】
改进的RNA酶H和核酸扩增的检测本申请是申请日为2011年5月25日、申请号为201180026040.8、申请公布号为CN102918147A、并且专利技术名称为“改进的RNA酶H和核酸扩增的检测”的专利申请的分案申请。
本公开描述了一种改进的RNA酶H,用于改善RNA序列的实时逆转录-PCR检测。
技术介绍
研究基因表达的最广泛使用的技术之一是采用mRNA序列的第一链cDNA作为模板进行PCR扩增。结合逆转录-PCR技术测量PCR反应的动力学的能力使得以必需水平灵敏度来准确并精确测量靶RNA序列变得容易。具体地讲,诸如CATACLEAVETM核酸内切酶测定(在第5,763,181号美国专利中详细地描述;见图1)的荧光双重标记杂交探针技术允许实时的逆转录-PCR扩增的检测。通过在扩增反应中包括CATACLEAVETM探针连同RNA酶H来实现靶序列的检测。在逆转录-PCR扩增产物中与靶序列互补的CATACLEAVETM探针具有包括RNA序列和DNA序列的嵌合结构,并且在5'端和3'端两侧连接可检测标记,例如,FRET对标记的DNA序列。FRET对的荧光标记与淬灭剂的接近阻止了完整探针发射荧光。当探针与逆转录PCR产物退火时,产生能够通过存在于反应混合物中的RNA酶H切割的RNA:DNA复体。在退火探针的RNA部分内的切割导致荧光标记与淬灭剂的分离并导致随后的荧光发射。
技术实现思路
技术问题描述了一种可逆改进的“热启动”RNA酶H组合物,用于改善测试试样中核酸序列的CATACLEAVETM探针检测。酶组合物的关键特征是能够在逆转录PCR循环过程中调节RNA酶H ...
【技术保护点】
一种包含DNA聚合酶和可诱导的RNA酶H的热启动酶组合物,所述热启动酶组合物用于在PCR中检测试样中靶脱氧核糖核酸(DNA)序列的应用,其中,所述可诱导的RNA酶H使用顺式乌头酸酐或甲醛可逆地改进,并且所述可诱导的RNA酶H的RNA酶H活性在90℃或更高的温度被诱导。
【技术特征摘要】
2010.05.25 US 61/347,9841.一种包含DNA聚合酶和可诱导的RNA酶H的热启动酶组合物,所述热启动酶组合物用于在PCR中检测试样中靶脱氧核糖核酸(DNA)序列的应用,其中,所述可诱导的RNA酶H使用顺式乌头酸酐或甲醛可逆地改进,并且所述可诱导的RNA酶H的RNA酶H活性在90℃或更高的温度被诱导。2.根据权利要求1所述的热启动酶组合物,其中,所述可诱导的RNA酶H包含具有SEQIDNO:10、11、12或13的氨基酸序列的RNA酶H同源区域。3.根据权利要求1所述的热启动酶组合物,其中,所述RNA酶H同源区域与SEQIDNO:10、11、12或13的氨基酸序列具有至少70%的同源性。4.根据权利要求1所述的热启动酶组合物,其中,所述RNA酶H同源区域与SEQIDNO:10、11、12或13的氨基酸序列具有至少80%的同源性。5.根据权利要求1所述的热启动酶组合物,其中,所述RNA酶H同源区域与SEQIDNO:10、11、12或13的氨基酸序列具有至少90%的同源性。6.根据权利要求1所述的热启动酶组合物,其中,所述可诱导的RNA酶H从激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)、堀越氏火球菌(Pyrococcushorikoshi)、栖热球菌(Thermococcuslitoralis)、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)或大肠杆菌中分离。7.根据权利要求1所述的热启动酶组合物,其中,所述DNA聚合酶是热稳定DNA聚合酶。8.根据权利要求1所述的热启动酶组合物,其中,所述RNA酶H活性通过改变包含酶的溶液的pH诱导。9.根据权利要求1所述的热启动酶组合物,其中,甲醛是以0.2-1w/v%浓度包含甲醛的溶液。10.根据权利要求1所述的热启动酶组合物,所述热启动组合物还包含配体,其中,所述可诱导的RNA酶H活性受所述可诱导的RNA酶H与所述配体的结合抑制并且通过干扰所述结合而诱导。11.根据权利要求10所述的热启动酶组合物,其中,所述配体是热不稳定的。12.根据权利要求10所述的热启动酶组合物,其中,所述可诱导的RNA酶H与所述配体之间的所述结合是非共价的。13.根据权利要求10所述的热启动酶组合物,其中,所述配体是对于所述可诱导的RNA酶H具有10-1M或更小的KD解离常数的小分子。14.根据权利要求10所述的热启动酶组合物,其中,所述配体是对于所述可诱导的RNA酶H具有10-1M或更小的KD解离常数的肽或核酸。15.根据权利要求10所述的热启动酶组合物,其中,所述配体结合到RNA酶H结构域。16.根据权利要求10所述的热启动酶组合物,其中,所述配体诱导所述RNA酶H结构域中的构象变化。17.根据权利要求10所述的热启动酶组合物,其中,所述配体是抗体、抗体片段、适体或螯合剂。18.根据权利要求17所述的热启动酶组合物,其中,所述抗体片段是Fab、Fab'、F(ab')2、Fd或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGDCH2、小体、F(ab')3、四体、三体、二体、(scFv)2、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2或scFv-Fc。19.根据权利要求8所述的热启动酶组合物,其中,通过将包含所述可诱导的RNA酶H的溶液的pH降低到7.0或更低诱导所述RNA酶...
【专利技术属性】
技术研发人员:张文腾,詹森·欧普迪克,
申请(专利权)人:韩华泰科株式会社,
类型:发明
国别省市:韩国,KR
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