一种基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒，所述试剂盒包含Fuc‑POSTN半定量检测ELISA板、ELISA酶标板、磁珠‑AAL、Hp‑ELISA酶标板；Hp‑ELISA酶标板内填充有G1：5％SDS，G2：2.3单位/μL糖酰胺酶，G3A：110mM三磺酸三钠盐荧光标记物，G3B：1M有机物还原剂，G4：唾液酸酶，GW：去离子水。本发明专利技术所述的方法及试剂盒具有高通量性，较高特异性，检测快速准确等突出优点，适用于肝癌高发现场或者肝病人群大规模筛查，检测迅速便捷，对于提高肝癌的诊断率，实现早期干预治疗，降低肝癌病死率具有非常重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒
本专利技术属于医药学
，尤其涉及一种基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒。
技术介绍
HCC是一种多基因、多因素、病理机制复杂的常见恶性肿瘤。在我国，乙肝病毒携带者占人口的7.18％，是全世界乙肝携带者的2/3。与此相关的HCC患者数量庞大，占全世界的一半左右。绝大多数患者发病隐匿，出现临床症状后就医时已属晚期，丧失了治疗的良机，因此早期诊断对于提高患者的生存率至关重要。理想的肝癌标志物需要有较高的特异性，能够将肝癌与肝硬化、肝炎、肝脏再生结节等疾病区分开来；同时还需较高的敏感性，能够在肝癌早期即提示诊断，同时应具有易检测、可重复、可经非侵入性操作测定等特点。糖蛋白聚糖存在着宏观和微观的不均一性，其结构功能变化和与疾病发生发展有着密切的联系。聚糖在很多关键的生物学过程中起到重要作用，比如细胞黏附、分子运输和清除、受体激活、信号转导以及内吞作用等。在生物体发育过程中，聚糖结构也在变化，在不同的分化阶段，聚糖有不同的表达。在癌症的发生过程中，糖基化的改变是普遍存在的，如能关注糖基化的变化，可以提升诊断的特异性和敏感性。因此，利用检测糖蛋白聚糖结构的异常来诊断恶性肿瘤已引起相当重视，如AFP-L3的变化已成为检测肝癌的重要聚糖标志等。目前检测糖蛋白聚糖结构变化的技术方法有生物质谱、液相色谱和植物凝集素亲和印迹等，其中植物凝集素是一类存在于多数植物中的糖蛋白，其最大特点是能够识别糖蛋白和糖脂中的聚糖，特别是细胞膜中复杂结构的聚糖即细胞膜表面决定簇，它们与聚糖的结合是非共价且可逆的。POSTN是一种亲和α连接岩藻糖(TerminalαFuc和±Sia-Lex)的植物凝集素，岩藻糖修饰能赋予聚糖很多独特的功能特性，其在输血反应、凝集素介导的白细胞和内皮的粘附、宿主和微生物相互作用和个体发育等方面发挥重要作用。此外，岩藻糖还参与构成某些重要粘附分子的聚糖结构，与肿瘤转移关系密切。在癌症中发现sialylLewisx和sialylLewisa含量增多，许多肿瘤中A和B型血型抗原丢失伴随着H血型抗原和Lewisy表达升高。periostin(POSTN)为成骨细胞及成骨细胞样细胞系分泌的一种胞外基质分泌性蛋白，能促进成骨细胞及其前体在骨膜聚集及分化，最早是由日本学者Takeshita等从小鼠成骨细胞系MC3r13-E1cDNA文库中克隆的一种骨黏附分子。随着对其研究的加深，发现POSTN在许多种组织中都有高表达，尤其与肿瘤恶性程度及转移、炎症组织的增生及纤维化有着密切的关系，有望成为许多肿瘤及炎症相关疾病的诊断及治疗的检测指标。在前期工作中，发现肝癌患者血清单位POSTN亲和AAL能力显著增强，说明肝癌患者的单位POSTN岩藻糖基化聚糖含量增多。本专利技术应用POSTN对岩藻糖化聚糖的高亲和性，通过POSTN-ELISA和Protein-ELISA的制备与检测，分别形成POSTN抗体-抗原-生物素标POSTN复合物和POSTN抗体-抗原-生物素标抗体复合物，获得POSTN结合POSTN的吸光度与POSTN蛋白的吸光度比值Fuc-POSTN，通过对临床资料进行回顾性研究，建立肿瘤判别诊断函数，获得ROC曲线和Cutoff值，同时比较AFP-L3和Fuc-POSTN对肝癌诊断的准确率差异。本专利技术适用于肝癌高发现场或者肝病人群大规模筛查，对于提高肝癌的诊断率，实现早期干预治疗，降低肝癌病死率具有非常重要的意义。相比于目前诊断肝癌的各种成像技术，比如超声检查，计算机断层扫描，磁共振成像等，这些技术不能分辨良性的肝变化，例如发育不良的结节和硬化的大结节与肝癌的区别。业内主要选择血清肿瘤标志物来检测恶性肿瘤，而血清甲胎蛋白(AFP)作为唯一被广泛应用于诊断及复查肝癌的血清标志物，最近的分析显示AFP检测的灵敏度和特异性都有较大的波动范围，而且这些波动并不完全由于使用了不同的截止水平的阈值效应。目前，在临床上缺乏灵敏、特异的早期肝癌诊断标志物，能检测出的早期肝癌病例大约占所有肝癌病例的25％。因此，可以快速简便准确检测肝癌和跟踪检测肝癌治疗效果的检测产品具有十分广阔的市场。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒，旨在解决目前在临床上缺乏灵敏、特异的早期肝癌诊断标志物，检测肝癌和跟踪检测肝癌治疗效果不佳的问题。本专利技术是这样实现的，一种基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒，所述基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒包含Fuc-POSTN半定量检测ELISA板、ELISA酶标板、磁珠-AAL、Hp-ELISA酶标板；所述的Fuc-POSTN半定量检测ELISA板由POSTN-ELISA板、Protein-ELISA板组成；所述Hp-ELISA酶标板内填充有G1：5％SDS，G2：2.3单位/μL糖酰胺酶，G3A：110mM三磺酸三钠盐荧光标记物，G3B：1M有机物还原剂，G4：唾液酸酶，GW：去离子水。进一步，基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒的HCC预测模型：P＝exp(-0.915+0.275*Fuc-POSTN)/[1+exp(-0.915+0.275*Fuc-POSTN)]所述的Fuc-POSTN值的计算方法为：每个血清样品中POSTN结合POSTN的实际OD值与相同血清样品中POSTN蛋白的实际OD值的比值，所述的血清样品中POSTN结合POSTN的实际OD值通过POSTN-ELISA板检测得到，血清样品中POSTN蛋白的实际OD值通过Protein-ELISA板检测得到，该模型区分肝癌和肝硬化的Cutoff值为2.281；基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒还包含POSTN捕获抗体，其浓度为1μg/mL；还包含第一封闭剂和第二封闭剂，第一封闭剂为3.5％BSA溶液，用于封闭POSTN-ELISA板，第二封闭剂为含有1.5％BSA和0.06％NaN3的溶液，用于封闭Protein-ELISA板；还包含第一氧化剂，第一氧化剂为pH4.0的含有100mMNaIO4和50mM柠檬酸的溶液，用于POSTN-ELISA板的氧化；还包含生物素标记的POSTN和生物素标记的抗体；还包含采集血样装置及操作说明书。进一步，所述磁珠-POSTN中磁珠与POSTN的质量比为170～230:1；所述磁珠-POSTN拆分为磁珠、POSTN及磁珠-POSTN的制备相关试剂。进一步，所述G1的容积是100μL，G2的容积是60μL，G3A的容积是20μL，G3B的容积是20μL，G4的容积是45μL，GW的容积是4.5mL。进一步，所述磁珠-POSTN的制备方法包括步骤：1)将磁珠置于EDC溶液中反应；2)反应完成后，移除上清并用缓冲液清洗磁珠；3)取一定量的POSTN置于偶联液中，加入磁珠反应；4)反应完成后，封闭未反应的活化基团。进一步，基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒还包括：样品稀释液，所示样品稀释液为0.15MTris-HCl、0.18MNaCl、1.5mMCaCl2、1.5mMMgCl2、pH7.5的溶液；还包括HPR标记的Hp抗体。进一步，基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒使用方法，包括下列步骤：在不同试管中先加入2.5μL的含POST本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于，所述基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒包含Fuc‑POSTN半定量检测ELISA板、ELISA酶标板、磁珠‑AAL、Hp‑ELISA酶标板；所述的Fuc‑POSTN半定量检测ELISA板由POSTN‑ELISA板、Protein‑ELISA板组成；所述Hp‑ELISA酶标板内填充有G1：5％SDS，G2：2.3单位/μL糖酰胺酶，G3A：110mM三磺酸三钠盐荧光标记物，G3B：1M有机物还原剂，G4：唾液酸酶，GW：去离子水。

【技术特征摘要】
1.一种基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于，所述基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒包含Fuc-POSTN半定量检测ELISA板、ELISA酶标板、磁珠-AAL、Hp-ELISA酶标板；所述的Fuc-POSTN半定量检测ELISA板由POSTN-ELISA板、Protein-ELISA板组成；所述Hp-ELISA酶标板内填充有G1：5％SDS，G2：2.3单位/μL糖酰胺酶，G3A：110mM三磺酸三钠盐荧光标记物，G3B：1M有机物还原剂，G4：唾液酸酶，GW：去离子水。2.如权利要求1所述的基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于，基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒的HCC预测模型：P＝exp(-0.915+0.275*Fuc-POSTN)/[1+exp(-0.915+0.275*Fuc-POSTN)]Fuc-POSTN值的计算方法为每个血清样品中POSTN结合POSTN的实际OD值与相同血清样品中POSTN蛋白的实际OD值的比值，所述的血清样品中POSTN结合POSTN的实际OD值通过POSTN-ELISA板检测得到，相同血清样品中POSTN蛋白的实际OD值通过Protein-ELISA板检测得到，该模型区分肝癌和肝硬化的Cutoff值为2.281；基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒还包含POSTN捕获抗体，其浓度为1μg/mL；还包含第一封闭剂和第二封闭剂，第一封闭剂为3.5％BSA溶液，用于封闭POSTN-ELISA板，第二封闭剂为含有1.5％BSA和0.06％NaN3的溶液，用于封闭Protein-ELISA板；还包含第一氧化剂，第一氧化剂为pH4.0的含有100mMNaIO4和50mM柠檬酸的溶液，用于POSTN-ELISA板的氧化；还包含生物素标记的POSTN和生物素标记的抗体；还包含采集血样装置及操作说明书。3.如权利要求1所述的基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于，基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒还包括：样品稀释液，所示样品稀释液为0.15MTris-HCl、0.18MNaCl、1.5mMCaCl2、1.5mMMgCl2、pH7.5的溶液；还包括HPR标记的Hp抗体。4.如权利要求1所述的基于POSTN基因的肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于，所述磁珠-POSTN中磁珠与POSTN的质量比为170～230:1；所述磁珠-POSTN拆分为磁...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈钢，王怡，俞海涛，
申请(专利权)人：温州医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：浙江,33