一种基于流式细胞术的精子DFI检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于流式细胞术的精子DFI检测方法，特点是包括以下步骤：(1)将液化的精液用37℃缓冲液稀释精子至1～2×10

【技术实现步骤摘要】
一种基于流式细胞术的精子DFI检测方法
本专利技术涉及体外诊断试剂领域，尤其是涉及一种基于流式细胞术的精子DFI检测方法。
技术介绍
传统的精液检测方法主要针对精子的DNA碎片化，这些检测结果不能全面、准确地反映精子状况。精子的主要功能是保留并传递父辈的遗传信息，而DNA存在于精子体内，被鱼精蛋白包裹呈致密的结构。DNA是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸，即：腺嘌呤脱氧核苷酸(dAMP)、胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTMP)、胞嘧啶脱氧核苷酸(dCMP)、鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGMP)。而脱氧核糖(五碳糖)与磷酸分子借由酯键相连，组成其长链骨架，排列在外侧，四种碱基排列在内侧，遵循碱基互补配对原则。每个糖分子都与四种碱基里的其中一种相连，这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，指导蛋白质的合成。DNA存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息，因此维护DNA分子的完整性对细胞至关紧要。外界环境和生物体内部的因素都经常会导致DNA分子的损伤或改变，而且与RNA及蛋白质可以在细胞内大量合成不同，一般在一个原核细胞中只有一份DNA，在真核二倍体细胞中相同的DNA也只有一对，如果DNA的损伤或遗传信息的改变不能更正，对体细胞就可能影响其功能或生存，对生殖细胞则可能影响到其后代。DNA在正常状态下形成双螺旋结构，因此，正常状态下，DNA分子是完整的双链结构，而在体内DNA由于多种原因会导致DNA损伤，而损伤的DNA又对生物个体的繁衍产生重大影响；故对精子DNA完整性检测是意义非凡的。传统的精子DFI检测依赖于吖啶橙检测法，并通过显微镜观察精子样本，通过识别荧光颜色以及计数来计算DFI值。本公司通过DFI试剂盒对精子样本进行处理、染色，再通过流式细胞法对样本进行自动化分析，该方法检测结果过于依赖人为操作，检测结果主观性强；操作过程繁琐，检测效率低下，重复性差，敏感性较差特点。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种操作简单、结果易于判定、检测结果准确、稳定可靠、重复性好、且易于临床推广的基于流式细胞术的精子DFI检测方法。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于流式细胞术的精子DFI检测方法，包括以下步骤：(1)将液化的精液用37℃缓冲液稀释精子至1～2×106个/mL；(2)将500μL稀释过的精子加入到流式细胞仪上样管中，加入酸化处理缓冲液(主要成分为盐酸，目的是使紧密的DNA变得结构较为松散，以便于后续染色步骤进行)，30秒后加入AO染色液；(3)设定流式细胞仪的校准，将检测管上机，每管样本至少连续测定两次，每管样本至少记录样本主群5000个细胞并使用DFIView软件统计分析；(4)染色后的精子细胞悬液通过流式细胞仪收集精子的红绿荧光信号(即FITC与PerCP荧光信号)，通过收集到的红色荧光精子占收集精子总数的比例，判定样本的DNA碎片化程度；结果判断依据于建立的图像收集模板，主要是对荧光强度的要求(依据不同仪器的收集条件不同建立对应的模板，具体包括，以Calibur仪器为例，FITC荧光强度中位数处于收集范围的中部为400～600，PerCP荧光强度中位数为50～100；(5)测定后，分别用漂白剂、进样管清洁剂和除菌的双蒸水彻底清除残留于流式细胞仪进样线中的细胞碎片和荧光染料。步骤(1)中所述的缓冲液为氯化钠、磷酸二氢钾、葡萄糖、氯化钾、酸镁、氯化钙、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸二钠盐、碳酸氢钠、丙酮酸钠、牛血清白蛋白和乳酸钠的混合物。所述的酸化处理缓冲液为0.08mol/L盐酸。在酸化处理后利用吖啶橙染料与双链DNA结合发绿色或黄色荧光，与单链DNA结合发红色荧光的特性，确定精子DNA碎片化程度。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术一种基于流式细胞术的精子DFI检测方法，通过DFI试剂盒对精子样本进行处理、染色，包括精子DNA荧光染液和染色缓冲液。通过荧光标记、流式上机检测精子DNA碎片率，从而评估精子的DNA损伤程度，为不育症检查、辅助生殖治疗方案的选择提供帮助。该方法避免了传统方法检测结果过于依赖人为操作，检测结果主观性强；操作过程繁琐，检测效率低下，重复性差，敏感性较差特点，实现了精子DFI检测的简单、快速、准确、高通量检测并计算DFI的目的。附图说明图1为精子细胞群图形，图中用门圈中区域即为精子细胞主群；图2为精子细胞群荧光表达图，图中分为三群细胞，靠近FITC(纵轴)的群即为DNA完整性好的细胞群，靠近PerCP(横轴)的细胞群即为DNA完整性差的细胞群，位于俩群中间的细胞群是完整性较差的细胞群。具体实施方式以下结合附图实施例对本专利技术作进一步详细描述。具体实施例一种基于流式细胞术的精子DFI检测方法，包括以下步骤：(1)将液化的精液用37℃缓冲液稀释精子至1～2×106个/mL；其中缓冲液为氯化钠、磷酸二氢钾、葡萄糖、氯化钾、酸镁、氯化钙、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸二钠盐、碳酸氢钠、丙酮酸钠、牛血清白蛋白和乳酸钠的混合物；(2)将500μL稀释过的精子加入到流式细胞仪上样管中，加入酸化处理缓冲液(为0.08mol/L盐酸，目的是使紧密的DNA变得结构较为松散，以便于后续染色步骤进行)，30秒后加入AO染色液；在酸化处理后利用吖啶橙染料与双链DNA结合发绿色或黄色荧光，与单链DNA结合发红色荧光的特性，确定精子DNA碎片化程度；(3)设定流式细胞仪的校准，将检测管上机，每管样本至少连续测定两次，每管样本至少记录样本主群5000个细胞并使用DFIView软件统计分析；(4)染色后的精子细胞悬液通过流式细胞仪收集精子的红绿荧光信号(即FITC与PerCP荧光信号)，通过收集到的红色荧光精子占收集精子总数的比例，判定样本的DNA碎片化程度；结果判断依据于建立的图像收集模板，主要是对荧光强度的要求(依据不同仪器的收集条件不同建立对应的模板，具体包括，以Calibur仪器为例，FITC荧光强度中位数处于收集范围的中部为400～600，PerCP荧光强度中位数为50～100；如图1所示，为精子细胞群图形，图中用门圈中区域即为精子细胞主群；图2所示为精子细胞群荧光表达图，图中分为三群细胞，靠近FITC(纵轴)的群即为DNA完整性好的细胞群，靠近PerCP(横轴)的细胞群即为DNA完整性差的细胞群，位于俩群中间的细胞群是完整性较差的细胞群；(5)测定后，分别用漂白剂、进样管清洁剂和除菌的双蒸水彻底清除残留于流式细胞仪进样线中的细胞碎片和荧光染料。当然，上述说明并非对本专利技术的限制，本专利技术也并不限于上述举例。本
的普通技术人员在本专利技术的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本专利技术保护范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于流式细胞术的精子DFI检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将液化的精液用37℃缓冲液稀释精子至1～2×10

【技术特征摘要】
1.一种基于流式细胞术的精子DFI检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将液化的精液用37℃缓冲液稀释精子至1～2×106个/mL；(2)将500μL稀释过的精子加入到流式细胞仪上样管中，加入酸化处理缓冲液，30秒后加入AO染色液；(3)设定流式细胞仪的校准，将检测管上机，每管样本至少连续测定两次，每管样本至少记录样本主群5000个细胞并使用DFIView软件统计分析；(4)染色后的精子细胞悬液通过流式细胞仪收集精子的红绿荧光信号，通过收集到的红色荧光精子占收集精子总数的比例，判定样本的DNA碎片化程度；(5)测定后，分别用漂白剂、进样管清洁剂和除菌的双蒸水彻底清除残留于流式细胞仪进样线中的细胞碎片和荧光...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾桥，江南，房海燕，陈继勇，胡润环，
申请(专利权)人：浙江星博生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33