用于检测精子DNA碎片率的方法和试剂盒技术

本申请提供了用于检测精子DNA碎片率的方法和试剂盒。本申请提供的方法和试剂盒，基于流式细胞术，利用RNA酶消化精子试样中的RNA，从而消除精子RNA带来的混杂信号，检测结果更准确、稳定可靠、重复性好、且易于临床推广。

A method and kit for detecting DNA fragment rate of spermatozoa

【技术实现步骤摘要】
用于检测精子DNA碎片率的方法和试剂盒
本申请属于体外诊断试剂领域，具体涉及用于检测精子DNA碎片率的方法和试剂盒。
技术介绍
DNA是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸，即：腺嘌呤脱氧核苷酸(dAMP)、胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTMP)、胞嘧啶脱氧核苷酸(dCMP)、鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGMP)。脱氧核糖(五碳糖)与磷酸分子借由酯键相连，组成DNA长链骨架，排列在外侧，四种碱基排列在内侧，遵循碱基互补配对原则。每个糖分子都与四种碱基中的一种相连，这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，指导蛋白质的合成。精子的主要功能是保留并传递父辈的遗传信息。每个正常精子中含有23条染色体，其中DNA含量为3.32pg/精子，而RNA含量为0.2-0.3pg/精子，RNA含量达到精子DNA含量的6.02-9.04%。DNA存在于精子内，被鱼精蛋白包裹呈致密的结构。由于DNA存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息，维护DNA分子的完整性对细胞至关紧要。外界环境和生物体内部的因素都经常会导致DNA分子的损伤或改变，而且与RNA及蛋白质可以在细胞内大量合成不同，一般在一个原核细胞中只有一份DNA，在真核二倍体细胞中相同的DNA也只有一对，如果DNA的损伤或遗传信息的改变不能更正，对体细胞就可能影响其功能或生存，对生殖细胞则可能影响到其后代。正常状态下，DNA分子是完整的双链结构，而在体内由于多种原因会导致DNA损伤，而损伤的DNA会对生物个体的繁衍产生重大影响，因此，精子DNA的碎片程度反映了精子遗传物质的完整性，对精子DNA完整性检测是意义非凡的。精子DNA完整性检测常用方法有：(1)精子染色质结构分析法(spermchromatinstructureanalysis，SCSA)：此方法可进行定量检测，敏感性高，操作方便，检测时间短，能在几秒钟的时间内快速检测5000-10000个精子细胞，直接、客观；目前已有标准化的诊断标准来衡量DNA断裂程度。(2)精子染色质扩散法(spermchromatindispersion，SCD)：是流式细胞术专利技术之前检测DFI的标准方法，操作过程复杂，时间长，依赖主观判断。(3)彗星试验：定量检测，每次通过人工观察计数200-500个精子，检测时间长，方法复杂，主观性强，标准化困难。(4)末端标记法(TUNEL)：可检测凋亡精子，因其灵敏可靠被广泛用于细胞凋亡的研究。但是TUNEL试验有待于建立标准化方法，尚难用于临床精子常规检测。(5)8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)酶联免疫分析法：具有较高的灵敏度，需样品量小，是非损伤性的，快速而且选择性好。该方法存在一些缺点，如DNA的不完全酶解，可导致检测值比真实值偏高。(6)荧光原位标记法：直接、客观、高效快速，但应用较窄，多用于染色体整倍体检测。以上各类技术的优缺点比较如下表：序号产品/技术名称原理特点1精子染色质结构分析法(SCSA)吖啶橙与不同DNA结合后发不同荧光，经流式细胞仪统计计数。简便、高效、快速、客观、稳定、易标准化，是目前能为临床提供的最佳技术。2精子染色质扩散法(SCD)精子DNA在酸处理后去除核蛋白，经DAPI等染色后用显微镜观察。通过肉眼观察到核的扩散状况，速度慢，费时费力；检测结果依赖人的主观判断。3彗星试验(COMET)单细胞凝胶电泳灵敏度高，但难以建立标准化方法，难以应用于临床。4末端标记法(TUNEL)外源性核苷酸在酶的催化下与凋亡细胞中的单链或双链相结合。可检测凋亡精子，灵敏可靠；但难以建立标准化方法，难以应用于临床。58-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)酶联免疫分析法液相色谱分析，即将DNA酶水解样品用HPLC分离后定量测定8-OHdG。较高的灵敏度；但存在DNA的不完全酶解，导致检测值比真实值偏高；成本高、准确性低。6荧光原位杂交技术(FISH)探针杂交。可检测染色体非整倍体，难以用于DNA碎片检测。可见，与其他精子DNA完整性检测方法相比较，基于流式细胞术的SCSA方法的优势在于它是一种定量检测，敏感性高，操作方法简单，流式细胞仪快速检测能力大大缩短了检测时间，并能非常直接、客观、准确地分析数据，目前已经成为精子DNA完整性检测的首选方法。该方法检测精子DNA碎片率是基于吖啶橙检测法，吖啶橙与单链或双链DNA结合不同的荧光，通过识别荧光颜色以及计数来计算精子DNA碎片率值。但是，在传统流式细胞术检测精子DNA时，精子中的RNA也会成单链状态，同样与吖啶橙结合，发射的荧光与吖啶橙/单链DNA结合发射的荧光一样，从而造成DNA检测信号中包含了RNA检测信号，这样的检测结果不能全面、准确、真实地反映精子DNA本身状况。因此，亟需改进精子DNA碎片率的检测方法并开发相关产品。
技术实现思路
为了解决上述问题，一方面，本申请提供了基于流式细胞术检测精子DNA碎片率的方法，其包括利用核糖核酸酶对精子试样进行消化处理的步骤。在具体实施方案中，所述核糖核酸酶为不含DNA酶的核糖核酸酶A(RNaseA)。在具体实施方案中，所述核糖核酸酶的浓度为0.01-1mg/mL。在另一具体实施方案中，所述核糖核酸酶的浓度为0.1mg/mL。在具体实施方案中，所述消化处理的温度为15-70℃。在另一具体实施方案中，所述消化处理的温度为37℃。在具体实施方案中，所述消化处理的时间为3-10分钟。在另一具体实施方案中，所述消化处理的时间为5分钟。在具体实施方案中，本申请提供的方法还包括在消化处理之前利用稀释缓冲液将精子试样稀释至1～2×106个/mL的步骤。在具体实施方案中，所述稀释缓冲液为以下的混合物：0.01mol/LTris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)，0.15mol/LNaCl(氯化钠)，1mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸)和0.1％Triton-X100(聚乙二醇辛基苯基醚)；pH值为7.4。在具体实施方案中，本申请提供的方法还包括在消化处理之后利用酸化缓冲液处理精子试样，再加入吖啶橙染色液进行染色的步骤。在具体实施方案中，所述酸化缓冲液为以下的混合物：0.08mol/LHCl(盐酸)，0.15mol/LNaCl(氯化钠)和0.1％(聚乙二醇辛基苯基醚)；pH值为1.2。在具体实施方案中，所述吖啶橙染色液为以下的混合物：0.1mol/L柠檬酸，0.2mol/LNa2HPO4(磷酸氢二钠)，1mmol/LEDTA，0.15mol/LNaCl和6μg/mL吖啶橙。在具体实施方案中，本申请提供的方法还包括利用流式细胞仪对染色后的精子试样进本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测精子DNA碎片率的方法，其包括利用核糖核酸酶对精子试样进行消化处理的步骤。/n

【技术特征摘要】
1.用于检测精子DNA碎片率的方法，其包括利用核糖核酸酶对精子试样进行消化处理的步骤。


2.如权利要求1所述的方法，其中所述核糖核酸酶为不含DNA酶的核糖核酸酶A，其浓度优选为0.01-1mg/mL，更优选0.1mg/mL。


3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述消化处理的温度为15-70℃，优选37℃；时间为3-10分钟，优选5分钟。


4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在消化处理之前利用稀释缓冲液将精子试样稀释至1～2×106个/mL的步骤；其中所述稀释缓冲液为以下的混合物：0.01mol/LTris-HCl，0.15mol/L氯化钠和1mmol/LEDTA，并且所述稀释缓冲液的pH值为7.4。


5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在消化处理之后利用酸化缓冲液处理精子试样，再加入吖啶橙染色液进行染色的步骤；其中所述酸化缓冲液为以下的混合物：0.08mol/L盐酸，0.15mol/L氯化钠和0.1％Triton-X100，并且所述酸化缓冲液的pH值为1.2；所述吖啶橙染色液为以下的混合物：0.1mol/L柠檬酸，0.2mol/L磷酸氢二钠，1mmol/LEDTA，0.15mol/L氯化钠和6μg/mL吖啶橙。


6.如权利要求1至5中任一项所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾桥，胡西陵，陈继勇，
申请(专利权)人：浙江星博生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33