一种双标法检测精子线粒体膜电位和活性氧的方法技术

本发明专利技术公开了一种双标法检测精子线粒体膜电位和活性氧的方法，特点是包括待精液自然液化后，取5‑10万条精子加入到37℃预热的500μL精子培养缓冲液中混匀，并置于37℃水浴箱中加入10uL精子线粒体膜电位和活性氧联合染液，混匀37℃避光孵育，5‑30分钟内上流式细胞仪机检测的步骤；最后分别收集三种颜色荧光信号：绿色、橙色和红色；采用流式细胞仪自带软件分析结果，根据绿色和橙色荧光情况，确定线粒体膜电位高低；根据红色荧光情况，确定活性氧含量情况，优点是实现了一次性完成精子线粒体膜电位和活性氧的检测，且操作简单、快速、重复性好。

A double standard method for the detection of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in spermatozoa

【技术实现步骤摘要】
一种双标法检测精子线粒体膜电位和活性氧的方法
本专利技术涉及体外诊断试剂领域，特别涉及一种双标法检测精子线粒体膜电位和活性氧的方法。
技术介绍
线粒体的主要功能是产生能量，为精子运动提供ATP。线粒体的功能状态对精子存活起着重要作用，因为精子的运动能力与线粒体的活性密切相关，整个精子代谢所需的能量主要由线粒体提供。线粒体活性的改变会影响精子的能量供应。研究表明，线粒体还是细胞凋亡的调控中枢。线粒体膜电位又是启动细胞凋亡过程最早出现的因子，线粒体膜电位的测定对于精子质量和功能的测定意义尤为重要。因此，线粒体的功能状态是精子功能质量的一个关键性指标。通常对线粒体活性的评价主要通过检测线粒体的跨膜电位变化来分析。精子的线粒体上存在着跨膜电位，因此对线粒体活性的检测主要通过检测线粒体的跨膜电位变化。目前，检测精子线粒体活性的荧光探针主要有罗丹明123(Rhodamine123，R123)、MitoTrackerGreenFM(MITO)和5，5′，6，6′-四氯-1，1′，3，3′-四乙基苯并咪唑基-羰化青碘(5，5′，6，6′-tetrachloro-1，1′3，3′-tetraethylbenzimidazolyl-carbocyanineiodide，JC-1)等。虽然JC-1在许多实验中被广泛地的实验，但是其水溶性差的特性也使其很难在一些实验中使用。即使是在低浓度条件下，JC-1也会在水的缓冲液中析出。JC-10(5，6-Dichloro-1，1′，3，3′-tetraethyl-imidacarbocyanineiodide；EnhancedJC-1)是一种可以在需要高浓度染料的实验中替代JC-1。与JC-1相比，JC-10具有更好的水溶性，JC-10可以选择性的进入线粒体，认为JC-10是检测精子线粒体功能最适合的荧光探针，比JC-1染色的特异性更好。JC-10分子式为C25H27Cl2IN4，分子量为583.34，在检测精子线粒体功能过程中，当精子线粒体膜电位低时，以单体形式存在，其激发波长Ex＝490nm，发绿色荧光波长Em＝525nm；当线粒体膜电位高时，形成二聚体，发橙色荧光(发射波长Em＝590nm)。虽然单独使用JC-10染色能判断精子线粒体膜电位的高低，但不能准确地判断精子氧化应激活性氧的状态。活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)是指机体内或者自然环境中化学性质活泼、氧化能力很强的一类含氧物质，是机体组织正常的有氧代谢产物，主要包括过氧化氢(H2O2)、过氧化阴离子(O2-)、羟基(-OH)、活性氮类(NO等)等，具有核外不匹配对电子，能与任何分子发生氧化反应，从而改变后者的结构及功能。研究表明，生理水平的ROS是必需的，ROS在维持男性生殖生理功能如细胞信号转导、激素的产生、精子获能、顶体反应以及精子活力等方面发挥着重要作用。精子获能与精子尾部尤其是尾部中段的酪氨酸磷酸化水平密切相关，通过影响胞内环磷酸腺苷(cAMP)水平及脂质过氧化作用促进精子与卵母细胞的透明带结合，促进精子蛋白酪氨酸磷酸化-去磷酸化作用。如果阻断ROS的生成，精子将无法获能。ROS可能在许多不同的细胞类型中作为第二信使，它们亦是精子功能的重要调节子。但是ROS超过了机体抗氧化体系的还原能力时，机体即处于氧化应激状态，这将破坏细胞的DNA、蛋白质和脂类，促使细胞基因、结构及功能受损，甚至导致细胞死亡。ROS可造成精子线粒体的损伤，氧化应激在早期过程中可导致精子线粒体膜电位下降，引起精子线粒体脱落，数量减少，能量合成降低、精子线粒体膜脂质过氧化以及核基因组的DNA损伤，这不但影响线粒体膜上呼吸链和产生腺苷三磷酸酶系正常功能的发挥，还影响到线粒体呼吸功能所必需的DNA编码蛋白的合成，甚至导致胚胎着床前发育不良、早期流产率升高、子代基因缺陷、不育和肿瘤等。检测活性氧中的单线态氧的荧光探针有DPAX、DMAX、海萤荧光素类似物(FCLA)等；检测活性氧的过氧化氢的荧光探针有DCFH-DA(2′，7＇-Dichlorodihydrofluoresceindictate)，它是一种无荧光的物质，可转换成DCF(2＇，7＇-Dichlorofluorescein)，即二氯荧光素，后者具有强烈的荧光。也可以采用基于发射红光的萘荧光素类探针Naphtho-Peroxyfluob1(NPF1)等。检测活性氧中的超氧阴离子的荧光探针Hydroethidine(HE)，它是一种选择性和灵敏性都很好的超氧阴离子的荧光探针，在此基础上合成的Mito-HE，是一类基于溴乙非啶的检测超氧阴离子的荧光探针，它比HE具有更长的激发波长；另一种该类物质二氢乙锭(Dihydroethidium)，分子式为C21H21N3，分子量为315.41，可作为超氧阴离子的荧光探针，其激发波长为480-535nm，发射波长为610nm(红色荧光)。检测活性氧中的羟自由基的荧光探针MitoAR和MitoHR，这两种物质本身几乎都没有荧光，但和活性氧反应后就生成强荧光的物质HMTMR，他们将其用于活的线粒体中活性氧的测量。一种弱巯基反应性的氯甲基官能团化合物(mildlythiol-reactivechloromethylmoiety，MTCM)为非荧光还原态，在氧化时才会发出荧光，该染料也可以对活细胞线粒体进行染色并且其积累取决于膜电位，乙醛固定后，该染料可稳定保存，其分子式为C34H36Cl2N2，分子量为543.58，是一种远红荧光染料(吸收波长/发射波长约为640/662nm)，可用于对活细胞线粒体进行染色，并且该染料的积累取决于膜电位。乙醛固定后，该染料可稳定保存。上述对于精子线粒体膜电位和活性氧的检测均是基于单个荧光探针染色法(单标法)，如果检测两种目标物，则需要两种不同的实验操作。因此，上述现有的检测方法均存在不能同时检测精子线粒体膜电位和活性氧的缺点。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种操作简单、快速且重复性好的双标法检测精子线粒体膜电位和活性氧的方法。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种双标法检测精子线粒体膜电位和活性氧的方法，包括以下步骤：(1)待精液自然液化后，取5-10万条精子加入到37℃预热的500μL精子培养缓冲液中混匀，并置于37℃水浴箱中；(2)在步骤(1)得到的精子培养缓冲液中加入10μL精子线粒体膜电位和活性氧联合染液，混匀37℃避光孵育，5-30分钟内上流式细胞仪机检测；(3)分别收集三种颜色荧光信号：绿色、橙色和红色；采用流式细胞仪自带软件分析结果，根据绿色和橙色荧光情况，确定线粒体膜电位高低，发橙色荧光的细胞为膜电位高的细胞，发绿色荧光的细胞为膜电位低的细胞；根据红色荧光情况，确定活性氧含量情况，红色荧光强的细胞即为活性氧含量高的细胞，红色荧光弱的细胞即为活性氧含量低的细胞。步骤(1)所述的精子培养缓冲液配方为：7.4g/L氯化钠(NaCl)，0.366g/L碳酸氢钠(NaHCO3)，0.285g/L氯化钾(KCl)，0.154g/L磷酸氢二钠(N本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双标法检测精子线粒体膜电位和活性氧的方法，其特征在于包括以下步骤：/n(1)待精液自然液化后，取5-10万条精子加入到37℃预热的500μL精子培养缓冲液中混匀，并置于37℃水浴箱中；/n(2)在步骤(1)得到的精子培养缓冲液中加入10μL精子线粒体膜电位和活性氧联合染液，混匀37℃避光孵育，5-30分钟内上流式细胞仪机检测；/n(3)分别收集三种颜色荧光信号：绿色、橙色和红色；采用流式细胞仪自带软件分析结果，根据绿色和橙色荧光情况，确定线粒体膜电位高低，发橙色荧光的细胞为膜电位高的细胞，发绿色荧光的细胞为膜电位低的细胞；根据红色荧光情况，确定活性氧含量情况，红色荧光强的细胞即为活性氧含量高的细胞，红色荧光弱的细胞即为活性氧含量低的细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种双标法检测精子线粒体膜电位和活性氧的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)待精液自然液化后，取5-10万条精子加入到37℃预热的500μL精子培养缓冲液中混匀，并置于37℃水浴箱中；
(2)在步骤(1)得到的精子培养缓冲液中加入10μL精子线粒体膜电位和活性氧联合染液，混匀37℃避光孵育，5-30分钟内上流式细胞仪机检测；
(3)分别收集三种颜色荧光信号：绿色、橙色和红色；采用流式细胞仪自带软件分析结果，根据绿色和橙色荧光情况，确定线粒体膜电位高低，发橙色荧光的细胞为膜电位高的细胞，发绿色荧光的细胞为膜电位低的细胞；根据红色荧光情况，确定活性氧含量情况，红色荧光强的细胞即为活性氧含量高的细胞，红色荧光弱的细胞即为活性氧含量低的细胞。


2.根据权利要求1所述的一种双标法检测精子线粒体膜电位和活性氧的方法，其特征在于步骤(1)所述的精子培养缓冲液配方为：7.4g/L氯化钠，0.366g/L碳酸氢钠，0.285g/L氯化钾，0.154g/L磷酸氢二钠，0.153g/L硫酸镁，0.083g/L磷酸二氢钾，0.044g/L氯化钙，5.21g/LHe...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾桥，胡西陵，
申请(专利权)人：浙江星博生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33