基于荧光标记流式单分子计数的蛋白质含量计量基准方法技术

本发明专利技术基于荧光标记流式单分子计数蛋白质含量绝对测量方法包括：将待测蛋白质纯品用稀释液配制成或分步稀释至0.1mg/g‑1mg/g，稀释倍数记录D

A method of protein content measurement standard based on fluorescence labeled flow cytometry

【技术实现步骤摘要】
基于荧光标记流式单分子计数的蛋白质含量计量基准方法
本专利技术涉及生物化学检测领域，特别是涉及一种基于荧光标记流式单分子计数的蛋白质含量计量基准方法。
技术介绍
计量是实现单位统一、量值准确可靠的活动，研究建立高准确度的测量方法是计量学研究的重要内容之一。基准测量方法是一种具有最高计量学品质的测量方法，其操作可以被完全地描述和理解，最终不确定度可以用SI单位表述，测量结果不依赖被测量的测量标准。基准方法是形成量值源头的依据。随着生命科学和生物技术的发展，生命科学已经经历了从“描述生物学”向“实验生物学”再向“创造生物学”发展的过程，当今的生物学已经成为精准定量的科学。没有对生命体各类生命现象的精确测量，便难以对生命过程进行全方位的调控与干预。蛋白质作为一类重要的生物大分子，是生命活动的主要承担者，在体内各个生命活动如营养代谢、酶催化、激素、免疫、遗传、变异等过程中均离不开蛋白质功能的发挥。鉴于蛋白质生物体内的重要作用，它已经成为众多领域的检测靶标。例如在体外诊断中，常见的体外诊断项目中有一半以上检测对象为蛋白质；在食品安全中，160多种食品含有可以导致过敏反应的食品过敏原，其中大于90％的过敏原都是蛋白质，根据国内食品标签标识管理规定，相应的蛋白质过敏原均应被检测并被标识；在生物医药领域，目前已经批准150多个蛋白质药物上市，400多种蛋白质药物处于临床研究阶段，3000多种处于临床前研究阶段。不论是体外诊断，还是食品安全与用药安全，这些都关乎大众健康与国计民生，相关领域蛋白质检验结果的准确可比则是保证大众健康与安全的基石！通过建立量值溯源传递体系来保证检测结果的准确一致已经成为共识，是计量界的通行做法并在传统的物理计量与化学计量领域得到广泛和成功的应用。量值溯源传递体系的建立一是要有量值的源头，二是要有量值传递方法，尤其是要有具有较高测量准确度的“基标准”方法，才能保证国家基准复现的量值能够准确的传递到下一级的标准物质或工作计量器具上。高准确度量值传递方法的缺乏将导致即使国家基准能够复现出量值，也无法准确的传递下去，从而使得保证检测结果的准确可比成为空谈。因此，高准确度的计量方法研究在计量及量值溯源传递中具有举足轻重的作用。蛋白质含量是蛋白质的基本属性，它描述了被定义的“蛋白质分子”数量的多少，是蛋白质测量的基本量值，在各类蛋白质检测项目中占到了80％以上。因此，要保证蛋白质含量检测结果的准确可比，必须研究建立高准确度的蛋白质含量计量方法，才能实现蛋白质量值的准确传递，从而达到检测结果准确可比、实现检测结果的互通与互认、保证贸易公平、保护人民大众健康的目的。蛋白质含量测量方法按照测量准确度可以分为常规测量方法和高准确度的计量(潜)基准测量方法，常用的计量(潜)基准方法包括同位素稀释质谱法、质量平衡法和定量核磁法。按照测量原理可以分为滴定法、光谱法、色谱法、质谱法、电泳法、波谱法、综合法等，例如，常用的凯氏定氮、微量凯氏定氮等属于滴定法；双缩脲法、Folin-酚法(Lowry法)、考马斯亮蓝法等属于比色光谱法。按照测量过程中是否需要上一级标准，可以分为蛋白质含量绝对测量方法和相对测量方法两类。蛋白质含量绝对测量方法在测量过程中不需要同样的标准物质作为标准，而相对测量方法在测量过程中需要相应的标准物质绘制标准曲线，或者通过括弧法或单点法进行定量。质量平衡法、定量核磁法、凯氏定氮法属于绝对测量方法，而同位素稀释质谱法、液相色谱法、比色法等大多数蛋白质含量测量方法都属于相对测量方法。IDMS是应用稳定同位素进行化学分析的一种方法，在测定蛋白质含量时，该方法将一定量的同位素标记化合物添加到样品中，这些同位素标记化合物可以是同位素标记的元素、氨基酸、肽段或蛋白质。待同位素与样品混合均匀后进行水解或酶解的操作，再通过质谱技术检测反应后非标记物和标记物的比例，由此对蛋白质进行准确定量。由于该方法所采用的内标物与待测物具有几乎相同的物理化学性质，在分离和分析过程中始终在一起，因此能够消除掉前处理过程和分析过程中的系统误差。通过对非标记物和标记物比例的精确测量及所加入稀释剂的准确称量，有效地保证了高精度和高准确度。一旦稀释剂与样品反应平衡，同位素比值恒定，在保证测量操作正确的情况下检测结果很难受到影响，具有很高的稳定性。而高灵敏度的质谱可以提高IDMS的检测水平，进行微量、痕量以及超痕量的分析。质量平衡法(MassBalanceMethod)是一种高纯固体蛋白质含量绝对测量方法，其测量结果具有很小的不确定度。它将主成分的含量作为1，然后采用各种技术对其中含有的无机成分、有机杂质、挥发性成分、水分等逐一进行测定并扣除，从而对物质进行绝对定量。该方法在有机高纯小分子的纯度测定中应用广泛，在蛋白质准确定量中，仅用于肽段或小蛋白质的测定，总的来说，由于蛋白质组成复杂，该方法在蛋白质含量准确测定中的应用还十分有限。定量核磁共振技术(qNMR)是近些年提出的在核磁共振技术的基础上，向样品中加入定量已知的标记物，后根据被测物的分子量、选定的定量积分信号以及产生该信号的质子数，代入计算公式边可以定量研究。此外，作为新型的定量技术，qNMR有分析速度快、预处理简单等特点。受到谱峰重叠的干扰，定量核磁技术也只能用于小的肽段或蛋白质的准确定量。上述这些方法在进行蛋白质定量时，同样需要使用一种化学品的标准物质来做标准，其量值不是直接溯源到SI单位的；同时，上述测定方法蛋白质含量的测定结果是基于其一级序列的蛋白质浓度，不能反映出蛋白质的活性；另外，同位素稀释质谱测定过程中需要将蛋白质分解成小分子如氨基酸或者肽段以后进行测定，在水解或者酶解过程中，可能引入一定的不确定度。因此，建立一种能够不依赖任何标准品直接对目标蛋白质进行定量的基准方法是十分必要和迫切的。
技术实现思路
本申请的专利技术目的克服现有测量方法的缺陷，而提供一种基于荧光标记流式单分子计数技术对溶液中蛋白质含量进行直接测定的技术，在测定过程中不必依赖任何标准品，测定结果可以直接溯源到SI单位，符合计量基准方法的定义。为了完成本申请的专利技术目的，本申请采用以下技术方案：(1)用含有表面活性剂、有机溶剂和缓冲盐的水溶液作为稀释液，将蛋白质固体配制成0.1mg/g-2mg/g的待测蛋白质溶液，记录稀释倍数D1＝1；或用上述稀释液来稀释经过粗测的浓度的待测蛋白质溶液至0.1mg/g-2mg/g，记录稀释倍数D1，得浓度为0.1mg/g-2mg/g的待测蛋白质溶液；(2)将荧光染料加入到上述浓度为0.1mg/g-2mg/g的待测蛋白质溶液中，对溶液中的蛋白质分子进行标记，使荧光染料与每个蛋白质分子充分结合，形成荧光标记蛋白质分子，得到标记好的溶液；(3)将标记好的溶液中的荧光标记蛋白质分子与过量荧光染料进行分离，收集被截留的荧光标记蛋白质分子组分，除去过量的未结合的染料，得到纯化好的荧光标记蛋白质分子；(4)用步骤(1)的稀释液对纯化好的荧光标记蛋白质分子进行稀释，稀释到100-1000分子/μL的浓度水平，稀释倍数为D本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于荧光标记流式单分子计数的蛋白质含量绝对测量方法，其特征在于：包括以下步骤：/n(1)用含有表面活性剂、有机溶剂和缓冲盐的水溶液作为稀释液，将蛋白质固体配制成0.1mg/g-2mg/g的待测蛋白质溶液，记录稀释倍数D

【技术特征摘要】
1.一种基于荧光标记流式单分子计数的蛋白质含量绝对测量方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)用含有表面活性剂、有机溶剂和缓冲盐的水溶液作为稀释液，将蛋白质固体配制成0.1mg/g-2mg/g的待测蛋白质溶液，记录稀释倍数D1＝1；或用上述稀释液来稀释经过粗测的浓度的待测蛋白质溶液至0.1mg/g-2mg/g，记录稀释倍数D1，得浓度为0.1mg/g-2mg/g的待测蛋白质溶液；
(2)将荧光染料加入到上述浓度为0.1mg/g-2mg/g的待测蛋白质溶液中，对溶液中的蛋白质分子进行标记，使荧光染料与每个蛋白质分子充分结合，形成荧光标记蛋白质分子，得到标记好的溶液；
(3)将标记好的溶液中的荧光标记蛋白质分子与过量荧光染料进行分离，收集被截留的荧光标记蛋白质分子组分，除去过量的未结合的染料，得到纯化好的荧光标记蛋白质分子；
(4)用步骤(1)的稀释液对纯化好的荧光标记蛋白质分子进行稀释，稀释到100-1000分子/μL的浓度水平，稀释倍数为D2，得到稀释了D2倍的荧光标记蛋白质溶液；
(5)采用单分子分析仪对稀释D2倍的荧光标记蛋白质溶液直接进行流式计数,得到单分子计数结果w，单位为min-1，为了测定单分子分析仪的质量流速，用纯水在指定时间内流过单分子分析仪的质量和上述指定的时间之比，得到单分子分析仪的质量流速f，单位为mg/min；
(6)根据由单分子分析仪照射出来的激光斑点和毛细管组成的检测区域与液体占据的几何区域的体积之比，计算出检测概率p；
(7)根据单分子计数结果w、质量流速f、稀释倍数D和检测概率p，计算待测蛋白质溶液的质量浓度：



其中：
c——待测蛋白质的质量浓度，mg/g；
M——待测蛋白质的摩尔质量，g/mol；
D——进行单分子计数分析时的稀释倍数，D＝D1×D2,无量纲；
NA——阿伏伽德罗常数，mol-1；
f——质量流速，mg/min；
w——荧光分子计数，min-1；
p——检测概率，无量纲。


2.根据权利要求1所述的基于荧光标记流式单分子计数的蛋白质含量绝对测量方法，其特征在于：在所述步骤(1)中，所述的蛋白质为纯度大于99％的蛋白质，用SDS-PAGE、凝胶排阻高效液相色谱、反相高效液相色谱、离子交换高效液相色谱、芯片电泳、毛细管电泳或双向电泳来检测待测蛋白质的纯度，所述粗测的浓度为用紫外吸收、考马斯亮蓝、Bradford或高效液相色谱方法进行的。


3.根据权利要求2所述的基于荧光标记流式单分子计数的蛋白质含量绝对测量方法，其特征在于：所述的稀释液溶液包含：占稀释液溶液体积0.1％～10％的表面活性剂和占稀释液溶液体积0.1％～30％的有机溶剂，表面活性剂为吐温20或HEPES；有机溶剂为乙腈、甲醇或异丙醇；缓冲盐为磷酸盐、醋酸盐或硼酸盐；用磷酸、乙酸或硼酸调整稀释液溶液的pH值，使稀释液溶液的等电点与待测蛋白质的等电点相同。


4.根据权利要求2所述的基于荧光标记流式单分子计数的蛋白质含量绝对测量方法，其特征在于：所述的稀释液溶液包含10mM～100mM的磷酸盐；或者包含0.1M～1.0M的醋酸盐；或者包含0.1M～1.0M的硼酸盐。


5.根据权利要求4所述基于荧光标记流式单分子计数的蛋白质含量绝对测量方法，其特征在于：所述荧光染料的波长与单分子分析仪的激光光源波长和检测器的敏感波长...

【专利技术属性】
技术研发人员：武利庆，杨彬，高运华，王迪，刘亚辉，金有训，王晶，
申请(专利权)人：中国计量科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11