具有补体调节活性的重组补体因子H‑免疫球蛋白融合蛋白及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种融合蛋白CFH‑Ig，为具有补体调节活性尤其是补体旁路途径调节活性的重组补体因子H(CFH)和免疫球蛋白(Ig)的融合蛋白。所述融合蛋白CFH‑Ig具有补体调节活性尤其是补体旁路途径调节活性，或同时具有靶向至补体异常激活组织的作用。本发明专利技术还涉及所述融合蛋白的制备方法和在制备治疗人类或者其它哺乳动物中由补体旁路途径介导、失调或缺陷所致的自身免疫性疾病或其它疾病以及因补体过度激活而引起的血栓的药物中的应用。

With protein and its preparation method and application of fusion complement regulatory activity of recombinant complement factor H immunoglobulin

The invention discloses a fusion protein of CFH Ig with complement regulatory activity especially recombinant complement factor H pathway of complement regulatory activity (CFH) and immunoglobulin (Ig) fusion protein. The fusion protein CFH Ig with complement regulatory activity especially the pathway of complement regulatory activity, or both targeted to complement abnormal activation of the role of the organization. The invention also relates to a preparation method of the fusion protein and in preparation for humans or other mammals by the pathway of complement mediated disorders, or defects caused by autoimmune diseases or other diseases caused by excessive activation of complement and drug induced thrombosis in use.

【技术实现步骤摘要】
具有补体调节活性的重组补体因子H-免疫球蛋白融合蛋白及其制备方法与应用
本专利技术属于基因工程领域中的融合蛋白，特别是涉及一种具有补体调节活性尤其是补体旁路途径调节活性的重组补体因子H(CFH)融合蛋白，其包含全长CFH或具有生物活性的CFH片段或其片段组合的CFH结构域与免疫球蛋白重链恒定区(CH)结构域，还涉及所述融合蛋白的制备方法和用途。
技术介绍
补体(Complement)是存在于正常人和动物血清与组织液中的一组具有免疫调节功能的蛋白质的总称，包含有C1、C2、……C9等，是先天免疫系统的主要效应物。补体是由30余种可溶性蛋白、膜结合性蛋白和补体受体组成的多分子系统，故称为补体系统(Complementsystem)。根据补体系统各成分的生物学功能，可将其分为补体固有成分、补体调控成分和补体受体。补体系统主要参与外源病原体的定靶和清除，也参与免疫复合物和细胞碎片的排除以及增强细胞免疫。补体系统并被证明在多种自身免疫、炎症等疾病的病理学过程中扮演重要角色(EhrnthallerC,IgnatiusA,GebhardF,Huber-LangM.Newinsightsofanolddefensesystem:structure,function,andclinicalrelevanceofthecomplementsystem.MolMed.2011,17(3-4):317-329.)。补体激活的过程有经典途径(Classicalpathway)、凝集素途径(Mannose-bindinglectinpathway)和旁路途径(Alternativepathway)三种(NesargikarPN,SpillerB,ChavezR.Thecomplementsystem:history,pathways,cascadeandinhibitors.Eur.J.Microbiol.Immunol(Bp).2012,2(2):103-111.)。经典途径是由补体成分C1(C1复合体由一个Clq分子、二个Clr分子、二个Cls分子组成)与经典途径激活因子(主要是含有IgM、IgG1、IgG2或IgG3的抗原-抗体复合物)的结合而激活的，C1q与单个IgM分子或相邻两个IgG分子结合，继而激活C1r和C1s，经典补体激活途径的反应顺序是：C1、C4、C2、C3、C5、C6、C7、C8、C9。在凝集素途径中，甘露糖结合凝集素在补体激活过程中扮演的角色类似经典途径的C1q蛋白质，与病原体表面的甘露糖残基和果糖残基结合，另与MASP-1和MASP-2两种蛋白(类似C1r和C1s)组成激活补体的复合物，继续进行类似经典途径的反应。旁路途径的起始依赖血清C3自然水解成C3a、C3b，继而C3b附着到靶细胞表面与B、D、P因子结合进入类似经典途径的步骤。自C3b产生以后，三条途径的反应非常类似。三条途径在各自形成C5转化酶之后C5裂解成C5a、C5b两部分，C5b则与C6、C7、C8、C9形成所谓膜攻击复合物(Membrane-attackcomplex，MAC)，在目标细胞的细胞膜上产生10nm左右的穿孔，导致目标细胞因为渗透压无法维持而膨胀破裂。正常情况下，补体系统的激活只发生在入侵病原体的表面，而不会损伤人体细胞本身。补体因子H(ComplementH，CFH)是在旁路补体激活过程中实现这种“自我”与“非我”识别的关键分子(FerreiraVP,PangburnMK,CortésC.ComplementcontrolproteinfactorH:thegood,thebad,andtheinadequate.MolImmunol.2010,47(13):2187-2197.)。在旁路途径中，附着在靶细胞表面的C3b与补体因子B结合，随后补体因子D切割B因子产生具有酶活性C3bBb，C3bBb与P因子结合形成C3bBbP(旁路途径的C3转化酶)。C3bBbP切割C3生成C3b，进一步引起激活，形成急速放大的正反馈环。而CFH可以与C3b结合，竞争B因子的结合位点，从而阻断C3bBb的形成，而且作为辅因子激活因子I对C3b的降解形成iC3b，iC3b则不能与B因子结合，还能加速已经形成的C3bBb复合体的不可逆性衰变，因此通过多重效应对旁路途径的激活施加抑制作用。CFH是一种糖蛋白，在血浆中浓度很高(～500μg/mL)，主要由肝脏产生，成熟的CFH由1213个氨基酸组成，是一个由20个短同源重复序列(Shortconsensusrepeats，SCR)或补体调控蛋白模块(Complementcontrolproteinmodules，CCP)构成的类似串珠状的结构。这些SCR按从N端到C端的顺序分别命名为SCR1至SCR20。每个SCR由约60个氨基酸组成，在空间结构上高度相似。CFH与C3b主要通过两个结合位点相互作用，分别位于SCR(1-4)(结合完整的C3b)和SCR(19-20)(结合C3d部分)，有报道SCR(6-14)也有结合C3b的功能(结合C3c片段)(SharmaAK&PangburnMK.IdentificationofthreephysicallyandfunctionallydistinctbindingsitesforC3binhumancomplementfactorHbydeletionmutagenesis.Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996,93:10996-11001.；JokirantaTS,etal.EachofthethreebindingsitesoncomplementfactorHinteractswithadistinctsiteonC3b.JBiolChem.2000,275(36):27657-62.)。CFH与固定在细胞表面的C3b结合后，能粘附到细胞表面，抑制C3bBb的形成。现有的研究表明，CFH的补体抑制活性结构域位于SCR(1-4)，SCR(1-4)具有与C3b结合、补体因子I的辅因子作用和加速C3bBb衰变的作用。CFH还有与细胞表面C3受体CR3和糖胺聚糖(Glycosaminoglycans，GAGs)结合的位点，主要分别位于SCR7和SCR(19-20)(AslamM&PerkinsSJ.Folded-backsolutionstructureofmonomericfactorHofhumancomplementbysynchrotronX-rayandneutronscattering,analyticalultracentrifugationandconstrainedmolecularmodelling.JMolBiol.2001,309(25):1117–1138.)。因GAGs通常只存在于正常动物个体的细胞表面，而细菌、病毒等病原物的表面不具有这种结构，所以CFH通过这样的特异性识别作用保护自身细胞免受旁路途径引起的攻膜复合体的破坏。CFH结构中SCR(6-8)和SCR(18-20)还能与固定在组织或细胞表面的C-反应蛋白(CRP)结合，在炎症过程中减少补体过度激活对组织造成的损伤(Per本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有补体调节活性的重组补体因子H‑免疫球蛋白融合蛋白，为具有补体调节活性尤其是补体旁路途径调节活性的重组补体因子H(CFH)和免疫球蛋白(Ig)的融合蛋白，其包含：a)含有CFH或其片段或其片段组合的补体因子H部分，和b)含有免疫球蛋白重链恒定区(CH)的免疫球蛋白部分，其中，所述补体因子H部分具有补体调节活性尤其是补体旁路途径调节活性，即具有抑制或调控补体旁路途径过度激活的作用，或同时具有靶向被补体过度激活的组织的作用；其中，所述免疫球蛋白部分具有延长其在生物体内半衰期的作用。

【技术特征摘要】
2015.12.31 CN 20151102803191.一种具有补体调节活性的重组补体因子H-免疫球蛋白融合蛋白，为具有补体调节活性尤其是补体旁路途径调节活性的重组补体因子H(CFH)和免疫球蛋白(Ig)的融合蛋白，其包含：a)含有CFH或其片段或其片段组合的补体因子H部分，和b)含有免疫球蛋白重链恒定区(CH)的免疫球蛋白部分，其中，所述补体因子H部分具有补体调节活性尤其是补体旁路途径调节活性，即具有抑制或调控补体旁路途径过度激活的作用，或同时具有靶向被补体过度激活的组织的作用；其中，所述免疫球蛋白部分具有延长其在生物体内半衰期的作用。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述补体因子H部分可以是一个或多个CFH全长序列，也可以是具有生物活性的任何CFH分子N-端短同源重复序列(SCR)中SCR1-SCR17之间的任一片段中的一个或多个的重叠、或多个不同片段的组合，所述SCR1-SCR17包括SCR(1-3)、SCR(1-4)、SCR(1-5)、SCR(1-6)、SCR(1-7)、SCR(1-8)、SCR(1-9)、SCR(1-10)、SCR(1-11)、SCR(1-12)、SCR(1-13)、SCR(1-14)、SCR(1-15)、SCR(1-16)和SCR(1-17)，或者是SCR1-SCR17中的任一片段或多个片段的重叠或不同片段的组合与CFH分子C-端序列中SCR(18-20)和/或SCR(19-20)任意组合的产物；所述多个优选为2-4个。3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于：优选地，所述补体因子H部分可以是CFH全长序列，也可以是CFHSCR(1-4)或SCR(1-7)，或者是SCR(1-4)或SCR(1-7)与SCR(18-20)或SCR(19-20)任意组合的产物，或者是SCR(1-7)与SCR(18-20)组合的产物。4.根据权利要求1至3任一所述的融合蛋白，其特征在于：所述人全长CFH、人CFHSCR(1-4)、SCR(1-7)、SCR(18-20)和SCR(19-20)对应的氨基酸序列分别如序列表中SEQNO.1、SEQNO.2、SEQNO.3、SEQNO.4和SEQNO.5所示，或与所述序列具有至少90％同源性的氨基酸序列。5.根据权利要求1至4任一所述的融合蛋白，其特征在于：所述补体因子H部分可以来源于人类，也可以来源于其它物种如小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、狗、猪、羊和非人灵长类动物；优选地，CFH部分来源于人类、小鼠、大鼠和非人灵长类动物；更优选地，CFH部分来源于人类；所述免疫球蛋白部分可以是来源于人类或者其它物种如大鼠或小鼠的免疫球蛋白，优选地，是来源于人类的免疫球蛋白；所述免疫球蛋白重链恒定区可以选自不同的免疫球蛋白，如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，优选IgG，可以选自IgG的不同亚型IgG1、IgG2(IgG2a、IgG2b)、IgG3和IgG4，以及不同亚型之间的组合(如IgG2/IgG4)，更优选地，免疫球蛋白重链恒定区来自于IgG1、IgG2和IgG4。6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于：所述免疫球蛋白重链恒定区可以包括CH1区、铰链区、CH2区和CH3区，所述免疫球蛋白重链恒定区至少包括Fc片段(铰链区、CH2区和CH3区)；所述Fc部分，可以是来源于人类或者其它物种如大鼠或小鼠的免疫球蛋白Fc结构域，优选地，是来源于人类的免疫球蛋白Fc结构域；所述大鼠、小鼠和人的免疫球蛋白IgG1中Fc部分对应的氨基酸序列分别如序列表中SEQNO.6、SEQNO.7和SEQNO.8所示，或分别与SEQNO.6、SEQNO.7和SEQNO.8具有至少90％同源性的氨基酸序列。7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于：为CFH和Fc的融合蛋白，其连接顺序可以是Fc部分在N端，CFH部分在C端，即Fc-CFH；或CFH部分在N端，Fc部分在C端，即CFH-Fc；所述CFH和Fc以共价键方式连接，其共价连接方式可以...

【专利技术属性】
技术研发人员：包建新，楼亚平，
申请(专利权)人：江苏匡亚生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32