一种基于胚芽浸渍诱导板栗多倍体的方法技术

本发明专利技术属于果树育种技术领域，提供一种基于胚芽浸渍诱导板栗多倍体的方法，包括以下步骤：1)胚芽前处理，2)配制诱导药剂，3)诱导药剂浸渍胚芽，4)培育成苗，5)多倍体植株筛选。其中，所用诱导药剂为浓度0.1～1w/v％(优选0.5w/v％)的秋水仙素水溶液。本发明专利技术以板栗种子的胚芽为材料，在适宜的药剂浓度、胚根萌发长度(2.1～4.0cm)和药剂浸渍胚芽时长(48～84h，优选72h)等因素条件下，创建了一种基于胚芽浸渍诱导板栗多倍体的方法，可诱导产生大比率板栗多倍体植株，为今后提供一种切实可行的板栗多倍体诱导方法，从而为板栗倍性育种的成功提供技术支撑。

Method for inducing polyploid of chestnut based on embryo soaking

The invention belongs to the technical field of fruit breeding, provides a method for inducing polyploidy based on chestnut germ impregnation, comprising the following steps: 1) germ pretreatment, 2) were induced by chemicals, 3) induced by chemical impregnation germ, 4) Pei Yucheng Miao, 5) screening of polyploid plants. The inducing agent is a colchicine aqueous solution with a concentration of 0.1 to 1w/v% (preferably 0.5w/v%). The germ of chestnut seed germination in length as the material, chemical concentration, suitable for the radicle (2.1 ~ 4.0cm) and chemical impregnation germ length (48 ~ 84h, preferably 72h) and other factors under the condition of creating a method of inducing polyploid based on chestnut germ impregnation, can induce large polyploid ratio of chestnut in plants, provides a feasible method for inducing polyploidy of chestnut, which provide technical support for chestnut ploidy breeding success.

【技术实现步骤摘要】
一种基于胚芽浸渍诱导板栗多倍体的方法
本专利技术属于果树育种
，具体地说，涉及一种基于胚芽浸渍诱导板栗多倍体的方法。
技术介绍
板栗原产中国，栽培历史悠久，是优良的干果树种。中国板栗三分之二以上的种植面积位于经济欠发达的边老穷山区，随着历史的发展逐渐形成了独具特色的山区板栗产业，成为山区农民贫致富的重要经济依赖。品种是一个产业得以健康发展的重要保证，也是永恒的基础支撑。目前，国内外均采用多种方式来培育新品种为生产服务，植物上获得新品种的主要方式包括：实生选种、芽变选种、杂交育种、辐射育种、转基因育种、多倍体育种等，其中多倍体育种一直是应用普遍、育种效果突出的新品种培育方式之一。多倍体是指具有三套或者三套以上完整染色体组的所有个体。染色体组加倍使植物体可用的遗传物质增加，重复的基因可能会发生功能分化，从而使多倍体物种在自然选择中具有更大环境适应优势，如更强的抗旱能力、抗病虫害能力、无融合生殖等，使植物可以适应更广泛的自然环境(Rieseberg等，2003)。自然而生的多倍体数量是有限的，随着开发利用的深入，发掘难度不断增大，可利用资源也越来越少，因此，要想更加充分地利用多倍体优势，仅靠自然多倍体是远远不够的，必须进行人工诱导创制多倍体，这是果树多倍体获得的主要途径(洪陈洁，2014)。在人工多倍体的诱导中，最常用的方法是化学诱导，即采用诱变剂处理植物体内最旺盛、最活跃的组织器官，如对萌动状态或刚发芽的种子、幼苗或嫩枝的生长点、芽、花蕾或愈伤组织等进行处理，从而诱导产生多倍体(韦荣昌，2013)。这种方法最大的优点就是诱导作用的高度专一性，从而使诱导效果显著，较易获得多倍体种质。常用的诱变剂有秋水仙素、富民农、萘嵌戊烷、吲哚乙酸、氧化亚氮等，其中使用最多最有效的就是秋水仙素。秋水仙素通过破坏细胞分裂中期纺锤丝的形成，使已经复制的染色体停留在赤道板上不能向细胞两极移动，原来为两个细胞所有的染色体停留在一个细胞核中，形成染色体加倍的细胞并由这些细胞产生了多倍体植株(翟中和，2008)。苹果、柑橘、梨、桃、葡萄等果树均已有利用秋水仙素诱导获得多倍体种质(品种)的报道。前期研究成果证实，在植物多倍化诱导过程中，由于各物种间遗传物质、器官构成、发育时期和细胞分化方式等因素千差万别，其达到好的多倍化诱导效果所需的药剂剂量、时间、材料等因素也各不相同(吴潇等，2016)。板栗的遗传背景复杂，保守性强，在目前的相关研究中，尚未发现有关通过化学诱导药剂处理胚芽获得多倍体板栗的报道。
技术实现思路
为了填补目前人工诱导板栗多倍体
的空白，本专利技术旨在提供一种基于板栗胚芽浸渍诱导板栗多倍体的方法，该方法可以获得大频率多倍化板栗植株。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供的基于胚芽浸渍诱导板栗多倍体的方法，包括以下步骤：1)胚芽前处理，2)配制诱导药剂，3)诱导药剂浸渍胚芽，4)培育成苗，5)多倍体植株筛选；其中，步骤2)配制的诱导药剂为浓度0.1～1w/v％的秋水仙素水溶液，优选浓度0.5w/v％。步骤1)胚芽前处理：选择健康充实的板栗种子，用湿沙层积催芽板栗种子，直至种子胚根萌发后取出，然后去除板栗种子内外种皮，横向切除子叶整体的一部分，露出子叶间隙，由此打开闭合的子叶，暴露出被子叶保护的胚芽，作为诱导处理材料。前述的方法，所述种子胚根萌发后取出是指待胚根萌发至长度为2.1～4.0cm时取出。所述切除子叶整体的一部分，是指切除子叶整体的1/3～1/2。步骤3)诱导药剂浸渍胚芽：选择规格为直径10cm，高2cm的培养皿，底部均匀覆盖脱脂棉，并用镊子压实保持最终厚度，将暴露出胚芽的板栗种子，摆放在脱脂棉层上。用脱脂棉层包裹住板栗种子暴露出的胚芽至根尖部位。将配制好的诱导药剂倒入培养皿中，直到培养皿底部和包裹胚芽、胚根的脱脂棉呈饱和状态。在如此状态下使诱导药剂水溶液浸渍板栗种子胚芽；浸渍过程中培养皿盖不封死，保持空气流通。前述的方法，所述用镊子压实保持最终厚度是指用镊子压实保持最终厚度为2～3mm，然后将暴露出胚芽的板栗种子，使胚芽朝上摆放在脱脂棉层上。所述用脱脂棉层包裹住板栗种子暴露出的胚芽至根尖部位是指用2～3mm厚的脱脂棉层包裹住板栗种子暴露出的胚芽至根尖部位。步骤3)使诱导药剂水溶液浸渍板栗种子胚芽是指使诱导药剂水溶液浸渍板栗种子胚芽48～84h，优选72h。步骤4)培育成苗：诱导药剂浸渍胚芽处理过程结束后，去除包裹胚根和胚芽的脱脂棉，将种子在蒸馏水中浸洗3～4次，然后将洗净的种子胚芽向上种入规格为高15cm，直径10cm装好沙土的营养钵中，一钵一种，播种时覆盖厚度为2±0.5cm的沙土层；营养钵内定期浇灌灭菌后的培养基，保证胚芽萌发育成的幼苗正常生长。其中，所述培养基为1/2MS液体培养基，每周1次，每次30ml。本专利技术所述板栗包括但不限于以下品种：冀栗1号、燕山早丰、燕山短枝。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述方法具体为：(1)胚芽前处理：以板栗种子的胚芽作为诱导处理材料。每年2月份，选择健康充实的板栗种子，用湿沙(湿度为60％左右的沙子，以用手捏成团，松手后又能散开为标准)层积催芽板栗种子，直至种子胚根萌发后长度为2.1～4.0cm时取出，然后去除板栗种子内外种皮，横向切除子叶整体的1/3～1/2(切除太多，胚芽成活率低；切除太少，药剂浸渍诱导效果差)，露出子叶间隙，由此打开闭合的子叶，暴露出被子叶保护的胚芽。(2)配制诱导药剂：配制秋水仙素的水溶液为诱导药剂，处理胚芽前1～2天配制好浓度为0.5w/v％的秋水仙素水溶液，置于温度1～6℃条件下备用。(3)诱导药剂浸渍胚芽：选择大小合适的培养皿(规格为直径10cm，高2cm)，底部均匀覆盖脱脂棉，并用镊子压实保持最终厚度为2～3mm，将暴露出胚芽的板栗种子，使胚芽朝上摆放在脱脂棉层上。用2～3mm厚的脱脂棉层包裹住板栗种子暴露出的胚芽至根尖部位。将配制好的诱导药剂缓缓倒入培养皿中，直到培养皿底部和包裹胚芽、胚根的脱脂棉呈饱和状态。如此状态使诱导药剂水溶液浸渍板栗种子胚芽72h。在此过程中培养皿盖不封死，保持空气流通，避免因氧气短缺引起的无氧呼吸对板栗种子、胚芽和胚根的毒害作用。(4)培育成苗：诱导药剂浸渍胚芽处理过程结束后，去除包裹胚根和胚芽的脱脂棉，将种子在蒸馏水中浸洗3～4次，浸洗过程轻缓，避免幼嫩的胚根和胚芽受到伤害。在组培培养室内，将清洗干净的种子种入装好沙土的营养钵中(规格为高15cm,直径10cm)，一钵一种，播种时要保持板栗种子胚芽朝上，且覆盖种子的沙土厚度为2±0.5cm，太薄不利于保持水分，太厚不利于胚芽的萌发生长。营养钵内定期浇灌灭菌后的1/2MS液体培养基，每周1次，每次30ml，保证胚芽萌发成的幼苗正常生长。(5)多倍体植株筛选：以通过诱导药剂浸渍胚芽处理后培育成的幼苗为材料，借助普遍公认的植株多倍体鉴定方法(比如流式细胞仪倍性鉴定或体细胞染色体计数等方法以及叶片大小、叶片厚度、节间长短、节间粗度等形态指标鉴定)，筛选获得板栗多倍体植株或多倍化嵌合体植株。本专利技术还提供上述方法在板栗多倍体育种中的应用。本专利技术以板栗胚芽为对象，筛选其适宜的倍性诱导时期、药剂剂量、部位等因素，创建了一套基于胚芽浸渍的板栗多倍体诱导技术，可获得大频率多倍体板本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于胚芽浸渍诱导板栗多倍体的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)胚芽前处理，2)配制诱导药剂，3)诱导药剂浸渍胚芽，4)培育成苗，5)多倍体植株筛选；其中，步骤2)配制的诱导药剂为浓度0.1～1w/v％的秋水仙素水溶液，优选浓度0.5w/v％。

【技术特征摘要】
1.一种基于胚芽浸渍诱导板栗多倍体的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)胚芽前处理，2)配制诱导药剂，3)诱导药剂浸渍胚芽，4)培育成苗，5)多倍体植株筛选；其中，步骤2)配制的诱导药剂为浓度0.1～1w/v％的秋水仙素水溶液，优选浓度0.5w/v％。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)胚芽前处理：选择健康充实的板栗种子，用湿沙层积催芽板栗种子，直至种子胚根萌发后取出，然后去除板栗种子内外种皮，横向切除子叶整体的一部分，露出子叶间隙，由此打开闭合的子叶，暴露出被子叶保护的胚芽，作为诱导处理材料。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述种子胚根萌发后取出是指待胚根萌发至长度为2.1～4.0cm时取出；所述切除子叶整体的一部分，是指切除子叶整体的1/3～1/2。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)诱导药剂浸渍胚芽：选择规格为直径10cm，高2cm的培养皿，底部均匀覆盖脱脂棉，并用镊子压实保持最终厚度，将暴露出胚芽的板栗种子，摆放在脱脂棉层上；用脱脂棉层包裹住板栗种子暴露出的胚芽至根尖部位；将配制好的诱导药剂倒入培养皿中，直到培养皿底部和包裹胚芽、胚根的脱脂棉呈饱和状态；在如此状态下使诱导药剂水溶液浸渍板栗种子胚芽；浸渍过...

【专利技术属性】
技术研发人员：王广鹏，李颖，张树航，郭燕，张馨方，
申请(专利权)人：河北省农林科学院昌黎果树研究所，
类型：发明
国别省市：河北,13