测定水产品中孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物的方法技术

本发明专利技术涉及一种测定水产品中孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物的方法，包括方法步骤有：步骤一，样品制备；步骤二，提取待检测样品得待上机样品；步骤三，确定色谱条件；步骤四，确定质谱条件；步骤五，标准工作曲线的绘制；步骤六，灵敏度、准确度和精密度的确定。本发明专利技术方法首次同时测定被提取浓缩水产品基质中有/无色孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物，解决了传统的分别提取耗时、检测成本高的问题，离子响应值增高，灵敏度增强，检出限低，真正做到定性，定量准确、快速、高效、灵敏，可作为三类药物的可靠检测手段，适合大批量样品提取浓缩。

Method for determination of malachite green, quinolones and sulfa drugs in aquatic products

The invention relates to a method for determination of malachite green in aquatic product, quinolones, sulfonamides, including the steps: step one, sample preparation; step two, extracting the samples to be detected to stay on the sample; step three, determine the chromatographic conditions; step four, determine the mass spectrum conditions; step five, drawing standard working curve; step six, determine the sensitivity, accuracy and precision. The method of the invention for the first time by water extraction and concentration in the product matrix / colorless malachite green, quinolones, sulfonamides, were extracted from the time-consuming, solves the problem of high cost of traditional detection, ion response value increased, enhanced sensitivity, low detection limit, truly qualitative, quantitative, accurate, rapid, and sensitive. Can be used as a reliable tool for detecting three kinds of drugs, suitable for large batch sample extraction and concentration.

【技术实现步骤摘要】
测定水产品中孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物的方法
本专利技术属于分析化学中液质-质联仪的应用及生态环境安全
，特别是一种应用液质-质联用仪同时测定水产品中孔雀石绿、喹诺酮类及磺胺类药物的方法。
技术介绍
随着水产动物集约化养殖程度的提高以及养殖环境不断的恶化，水产动物病害呈现发病种类多、覆盖范围广、发病时间不固定的特点，养殖业者为了避免病害造成的经济损失，使用大量的药物与消毒制剂，加上目前没有专门水产药物代替，轻“防”重“治”的现状，药物残留问题越来越突出，水产品质量安全问题受到政府及社会的极大关注。因孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物具有抗菌谱广、高效、价格低廉等特点，成为众多养殖户的首选药剂，因此孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物成为目前检出率最高的药残因子之一，从保护消费者身体健康的角度出发，我国颁布了一系列国家标准，明确规定了水产品中有害物质含量的限量值。学者首先开展了液相色谱法测定水产品药残技术研究，分别制定了SC/T3021-2004液相色谱测定水产品中孔雀石绿残留量，GB/T20361-2006高效液相色谱荧光检测定水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量，农业部958号公告-12-2007液相色谱测定水产品中磺胺类药物残留量，783号公告-2-2006液相色谱测定水产品中喹诺酮类药物残留量，随着科技的进步，即液相色谱之后，液质-质联用仪被推广应用，因其具有灵敏度高、定性准确等优点被质检机构所认可，学者开展了利用液质-质联用仪测定水产品中药残技术研究，分别制定了GB/T19857-2005液质-质测定水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量，GB/T22951-2008河豚鱼、鳗鱼中十八种磺胺类药物残留量的测定-液相色谱-串联质谱法，GB/T20751-2006鳗鱼及制品中十五种喹诺酮类药物残留量的测定-液相色谱-串联质谱法，农业部1077号公告-1-2008水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定-液相色谱-串联质谱法，另外有的学者还开展了酶联免疫法测定药残技术研究DB34/T1421-2011水产品中孔雀石绿及其代谢物残留量的快速筛选测定-酶联免疫法，DB51/T1278-2011生鲜乳中磺胺类药物残留的测定-胶体金免疫层析法，SN/T4535.1-2016商品化试剂盒检测喹诺酮类方法。综合以上检测技术，液相色谱法的优点是定量准确，缺点是容易受杂质干扰，定性准确度差，液质-质法测定较液相色谱法的优势是定性准确，受杂质干扰小，不足的地方是仪器维护成本较高，酶联免疫法测定且具有特异性和敏感性高和快速的特点，一般用来快速筛分，缺点是定量结果准确性低。当前，随着检测任务量加大，现有标准方法检测指标单一，检测耗时、检测成本高的问题日益凸显，为解决上述问题，将两个或几个单一检测指标整合为一个检测方法成为当前研究的热门课题。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对检测水产品中孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物现有技术的不足，而提出一种应用液质-质联用仪同时测定水产品中孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物的方法。本专利技术解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：一种测定水产品中孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物的方法，该方法是应用液质-质联用仪对水产品进行的检测，其特征在于包括方法步骤如下：步骤一，样品制备将被检测水产品取可食的肌肉部分样品切成不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的块后，置于绞肉机搅碎，制备好的样品置于-16℃至-20℃条件下保存；步骤二，提取(1)称取上述制备好的样品5.00±0.01g置于50mL离心管中，加入20μL混合有/无色孔雀石绿内标工作液，50μL喹诺酮及磺胺类内标工作液，涡旋20s，避光放置20min，加入10g无水硫酸钠，涡旋混匀，加入15mL，V乙腈：V浓盐酸＝1000:4的酸化乙腈，匀浆1min，超声提取10min，6000r/min离心5min，取上清液过中性氧化铝柱于50mL梨形瓶中；(2)在上述操作的残渣中再加入15mL乙酸乙酯重复提取1次，6000r/min离心5min，上清液合并于上述50mL梨形瓶中；(3)将上述50mL梨形瓶于水浴40℃旋转蒸发至近干，加入1mL定容溶液，再加入2mL正己烷去脂，过0.2μm微滤膜，得待上机样品；步骤三，确定色谱条件色谱柱：Shim-packXR-ODS(75mm×2.1mm)、柱温：35℃、样品室温度：10℃、流动相A：含0.1％甲酸的5mmoL/L的乙酸铵水溶液、流动相B：0.1％甲酸-乙腈溶液、进样体积：5.0μL、流速：0.25mL/min，具体参数见表1，表1流动相梯度洗脱程序步骤四，确定质谱条件(1)离子化模式：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；(2)离子源温度：600℃；(3)气帘气：20psi、碰撞气：中、雾化气：60psi、辅助气：40psi、喷雾电压：5000v；(4)扫描模式：多反应监测(MRM)，反应监测母离子、子离子、锥孔电压和碰撞能量见表2；表2目标化合物质谱条件步骤五，标准工作曲线的绘制(1)量取有/无色孔雀石绿100ng/mL标准工作8液0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mL，再量取100ng/mL氘代有/无色孔雀石绿0.2mL，混入工作液容量瓶中，流动相定容至10.0mL，外标浓度为0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL，内标浓度为2ng/mL；量取1.0μg/mL磺胺类、喹诺酮类0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0mL，再量取1.0μg/mL内标氘代磺胺、喹诺酮类取0.5mL，混入工作液容量瓶中，流动相定容至10.0mL，外标浓度为10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、200ng/mL，内标为50ng/mL；(2)内标法定量，试验结果，确定有/无色孔雀石绿质量浓度均在0.1～100ng/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，磺胺类和喹诺酮类质量浓度均在0.005～1μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性相关系数r2均大于0.999；步骤六，灵敏度、准确度和精密度的确定(1)灵敏度：在本方法规定的取样体积和定容体积下，按3倍信噪比计算得，有/无孔雀石绿检出限为0.1μg/kg，喹诺酮和磺胺类检出限为0.5μg/kg；(2)准确度：以信噪比S/N＞10得其定量下限(LOQ)，有/无色孔雀石绿定量限为0.25μg/kg，喹诺酮和磺胺类定量限为1.0μg/kg；(3)精密度：本方法批内相对偏差≤15％，批间相对偏差≤15％。而且，所述步骤二的(3)步中定容溶液为：乙腈:1mmol/L乙酸铵溶液含0.1％甲酸＝50:50。本专利技术的优点和积极效果是：1、本专利技术方法首次同时测定被提取浓缩水产品基质中有/无色孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物，解决了传统的分别提取耗时、检测成本高的问题，适合大批量样品提取浓缩。2、本专利技术利用AB5500QTrap液质-质联用仪将有/无色孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物重新优化，获取最佳质谱参数，优化后离子响应值增高，灵敏度增强，检出限低。3、本专利技术利用液质-质联用仪同时测定分析有/无色孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物，明显缩短化合物测定时间，真正做本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定水产品中孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物的方法，该方法是应用液质‑质联用仪对水产品进行的检测，其特征在于包括方法步骤如下：步骤一，样品制备将被检测水产品取可食的肌肉部分样品切成不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的块后，置于绞肉机搅碎，制备好的样品置于‑16℃至‑20℃条件下保存；步骤二，提取(1)称取上述制备好的样品5.00±0.01g置于50mL离心管中，加入20μL混合有/无色孔雀石绿内标工作液，50μL喹诺酮及磺胺类内标工作液，涡旋20s，避光放置20min，加入10g无水硫酸钠，涡旋混匀，加入15mL，V

【技术特征摘要】
1.一种测定水产品中孔雀石绿、喹诺酮类、磺胺类药物的方法，该方法是应用液质-质联用仪对水产品进行的检测，其特征在于包括方法步骤如下：步骤一，样品制备将被检测水产品取可食的肌肉部分样品切成不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的块后，置于绞肉机搅碎，制备好的样品置于-16℃至-20℃条件下保存；步骤二，提取(1)称取上述制备好的样品5.00±0.01g置于50mL离心管中，加入20μL混合有/无色孔雀石绿内标工作液，50μL喹诺酮及磺胺类内标工作液，涡旋20s，避光放置20min，加入10g无水硫酸钠，涡旋混匀，加入15mL，V乙腈：V浓盐酸＝1000:4的酸化乙腈，匀浆1min，超声提取10min，6000r/min离心5min，取上清液过中性氧化铝柱于50mL梨形瓶中；(2)在上述操作的残渣中再加入15mL乙酸乙酯重复提取1次，6000r/min离心5min，上清液合并于上述50mL梨形瓶中；(3)将上述50mL梨形瓶于水浴40℃旋转蒸发至近干，加入1mL定容溶液，再加入2mL正己烷去脂，过0.2μm微滤膜，得待上机样品；步骤三，确定色谱条件色谱柱：Shim-packXR-ODS(75mm×2.1mm)、柱温：35℃、样品室温度：10℃、流动相A：含0.1％甲酸的5mmoL/L的乙酸铵水溶液、流动相B：0.1％甲酸-乙腈溶液、进样体积：5.0μL、流速：0.25mL/min，具体参数见表1，表1流动相梯度洗脱程序步骤四，确定质谱条件(1)离子化模式：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；(2)离子源温度：600℃；(3)气帘气：20psi、碰撞气：中、雾化气：60psi、辅助气：40psi、喷雾电压：5000v；(4)扫描模式：多反应监测(MRM)，反应监测母离子、子离子、锥孔电压和碰撞能量见表2；表...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈永平，李春青，高丽娜，时文博，李连庆，孙晓旺，张素青，王娟娟，赵爽，
申请(专利权)人：农业部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心天津，
类型：发明
国别省市：天津,12