一种动物组织中喹诺酮类药物残留的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种动物组织中喹诺酮类药物残留的检测方法，是将测组织样品经预处理后，提取上清液加入超滤管中，超滤管放入离心机中离心，离心出的液体取出用氮气吹干，流动相定容，供仪器测定分析。该方法可同时检测10喹诺酮类药物残留，具有较好的回收率、稳定性和重复性。大分子杂质被截留，因此大大降低了基质效应。该方法完全可以满足动物源性食品中10种喹诺酮的日常检测要求。

【技术实现步骤摘要】
一种动物组织中喹诺酮类药物残留的检测方法
本专利技术属于兽药残留检测领域，具体涉及一种动物组织中喹诺酮类药物残留的检测方法。
技术介绍
喹诺酮类（Quinolones，QNs）药物是一类抗菌作用强、抗菌谱广的人工合成抗菌药，广泛应用于临床诊断、动物疾病预防及促生长。QNs在动物源食品中的过量或不当使用会引起食用者产生潜在“三致”（致癌、致畸、致突变）作用，诱导致病菌产生耐药性，从而威胁人类健。因此，许多国家和组织都限制其使用并制订出相应的最高残留限量（MRLs）：美国禁止在食用动物养殖中使用FQNs；日本批准使用的QNs仅有恩诺沙星、二氟沙星、奥比沙星、达氟沙星、马波沙星、氧氟沙星和恶喹酸。欧盟规定动物肌肉、肝脏和肾脏中达氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星（环丙沙星与恩诺沙星量之和）、保沙星、沙拉沙星等的MRLs为0.01mg-1.9mg，并在NO.508/1999号法规中对牛奶中单诺沙星、氟甲喹、马波沙星、恩诺沙星和环丙沙星的最高残留限量作了规定；世界食品法典委员会和世界各国对水产品中QNs残留均有严格的限量要求，国际贸易中也对其限量有严格规定；我国于2002年规定了环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、恶喹酸和氟甲喹等7种QNs药物在动物肌肉组织中的最高残留限量为10~500μg/kg。因此，对动物源食品中QNs残留量的检测尤为重要。目前QNs的检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、高效液相-串联质谱法（HPLC-MS/MS）、酶联免疫法（ELISA）等。其中HPLC-MS/MS法灵敏度高、检测限低、测定种类多、集高效分离和结构鉴定于一体，该仪器在我国检测机构中的配置也较为普遍，已成为复杂混合物中痕量组分定性和定量的有力工具，已经制定了相关国家标准。检测包括样品前处理和仪器分析两部分，而样品前处理技术严重落后于上机检测技术。样品前处理常用的有液液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）；LLE是净化QNs的基本方法，但存在操作费时、消耗高纯溶剂多以及样品易乳化等；SPE消耗溶剂少、不产生乳化现象，是净化QNs最常用的方法，但目前市场上商品化的固相萃取柱一般只能一次性使用，价格较高，从而导致了高成本。另外还有基质固相分散萃取、超临界流体萃取、固相微萃取、加速溶剂萃取和分子印迹固相萃取等较新的方法也应用至QNs残留分析，但都处于研究阶段，技术尚不成熟。本申请的专利技术人致力于动物源食品中喹诺酮类残留检测的研究，专利技术专利申请CN104316615A（膜透析-高效液相色谱串联质谱法测定动物源食品中7种喹诺酮残留的方法）中采用膜透析处理样品，在5.0、10.0、25.0μg/kg3个浓度添加水平平均回收率在65.5%～84.1%之间,变异系数在4.3%～11.6%之间，样品处理简单、灵敏度高，重现性好，经济，可用于动物源食品中7喹诺酮类残留的检测确证。但是采用膜透析法处理样品耗时长（透析时间≥6h），不利于样品的快速检测。超滤（ultrafiltration，UF）主要为筛分机理，通常为不对称结构，膜孔径的大小和膜表面的性质起着不同的截留作用。其过滤粒径介于微滤和反渗透之间，约2~100nm，操作压力在0.1~0.5Mpa。其出现为动物性食品中农兽药残留检测的前处理方法的改进提供了新的契机。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种动物组织中喹诺酮类药物残留的检测方法，采用超滤法对样品进行前处理，仪器分析采用HPLC-MS/MS，可同时检测动物源性食品中恩诺沙星(ENR)、环丙沙星(CIP)、恶喹酸(OXO)、沙拉沙星(SAR)、双氟沙星(DIF)、氟甲喹(FLU)、萘啶酸(NDL)、氧氟沙星（OFL）、诺氟沙星（NOR）、丹诺沙星（DAN）10种喹诺酮类药物。本专利技术的技术方案是：一种动物组织中喹诺酮类药物残留的检测方法，其包括步骤：将待测组织样品经预处理后，提取上清液加入超滤管中，超滤管放入离心机中离心，离心出的液体取出用氮气吹干，流动相定容，供仪器测定分析。其中，所述预处理步骤为：准确称取5.00g粉碎好的样品，加入20mL1%乙酸酸化乙腈，混匀，超声20min，加烘好后的无水硫酸钠5g混匀，8000r/min的速率离心5min；所述超滤管为50mL，截留分子量为3kD；所述离心为低温离心，优选5000r/min离心10min。本专利技术仪器测定分析采用HPLC-MS/MS，其液相色谱柱采用通用性，填料选自十八烷基键合相硅胶，流动相为0.1%甲酸溶液A-乙腈B，通过调整流动相比例和梯度均能达到满意的峰形和分离效果。采用WatersXbridgeC18,3.5μm2.1×150mm色谱柱时，流动相：0.1%甲酸溶液A-乙腈B，流速：0.2mL/min，梯度洗脱：t=0min,80%A,20%B；t=1min,80%A,20%B；t=6min,40%A,60%B；t=10min,20%A,80%B；t=14min,20%A,80%B；t=14.1min，80%A,20%B；t=20min,80%A,20%B；质谱条件为：电喷雾电离源正离子扫描(ESI+)，多反应监测模式(MRM)；电喷雾电压:5.0kV；离子源温度:500℃，雾化气压力(GSl):70psi；辅助气流速(GS2):55psi，气帘气压力(CUR):20psi；碰撞室入口电压(EP):10V；碰撞室出口电压(CXP):10V，监测分析物的离子对进行药物残留确证分析。本专利技术采用50mL，截留分子量3kD的超滤管，10种分子量在200-400间的喹诺酮经1%乙酸酸化乙腈提取，在离心力作用下均可从超滤管中被快速“过滤”出来，而被截留的大分子物质在离心时不会损坏超滤膜。该前处理方法可同时提取10种喹诺酮，应用本专利技术的HPLC-MS/MS测定，平均回收率在71.4%～85.9%之间,变异系数在3.9%～10.7%之间，具有较好的回收率、稳定性和重复性。另外，大分子杂质被截留，因此大大降低了基质效应。该方法完全可以满足动物源性食品中10种喹诺酮的日常检测要求。附图说明图1-图10为多反应监测的特征离子色谱图。具体实施方式1.样品的前处理准确称取5.00g粉碎好的样品，加入20mL1%乙酸酸化乙腈，混匀，超声20min，加烘好后的无水硫酸钠5g混匀，8000r/min的速率离心5min，取12mL左右上清液沿管壁慢慢加入超滤管中，5000r/min离心10min，将离心出的液体取出10mL用氮气吹干，流动相定容成1.0mL，供HPLC-MS/MS测定分析。2.液相色谱条件本实施例采用的色谱柱为WatersXbridgeC18,3.5μm2.1×150mm，AgilentZorbaxSB-C18、XDB-C18等十八烷基键合相硅胶也可以满足分离要求。进样量：20μL；流动相：A:0.1%甲酸溶液；B:乙腈；流速：0.2mL/min；梯度洗脱条件见表1。表1液相色谱梯度洗脱程序时间Time(min)A(%)B(%)080201.080206.0406010.0208014.0208014.1802020.080203质谱条件电喷雾电离源正离子扫描(ESI+)；多反应监测模式(MRM)；电喷雾电压:5.0kV；离子源温度:500℃；雾化气压力(GSl):70psi；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种动物组织中喹诺酮类药物残留的检测方法，其特征在于，其包括步骤：将待测组织样品经预处理后，提取上清液加入超滤管中，超滤管放入离心机中离心，离心出的液体取出用氮气吹干，流动相定容，供仪器测定分析；其中，所述预处理步骤为：准确称取5.00 g粉碎好的样品，加入20 mL1%乙酸酸化乙腈，混匀，超声20 min，加烘好后的无水硫酸钠5 g混匀，8000 r/min的速率离心5 min；所述超滤管为50 mL，截留分子量3kD；所述离心为低温离心，5000 r/min离心10min。

【技术特征摘要】
1.一种动物组织中喹诺酮类药物残留的检测方法，其特征在于，其包括步骤：将待测组织样品经预处理后，提取上清液加入超滤管中，超滤管放入离心机中离心，离心出的液体取出用氮气吹干，流动相定容，供仪器测定分析；其中，所述预处理步骤为：准确称取5.00g粉碎好的样品，加入20mL1%乙酸酸化乙腈，混匀，超声20min，加烘好后的无水硫酸钠5g混匀，8000r/min的速率离心5min；所述超滤管为50mL，截留分子量3kD，加入超滤管中的上清液为12ml；所述离心为低温离心，5000r/min离心10min；所述仪器测定分析采用HPLC-MS/MS，其液相色谱柱采用WatersXbridgeC18,3.5μm2.1×150mm，流动相：0.1%甲酸溶液A-乙腈B，流速：0.2mL/min，梯度洗脱：t=0min,80%A,2...

【专利技术属性】
技术研发人员：李兆杰，王静，鞠玲燕，胡巧茹，杨丽君，
申请(专利权)人：威海出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：山东;37