蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法技术

本申请公开了蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法：取新鲜蚕豆根系；液氮研磨；酚抽提液；Tris平衡酚饱和溶液；离心收集上层酚；0.1mol/L醋酸铵‑甲醇溶液；离心收集沉淀；甲醇清洗；离心收集沉淀；真空干燥沉淀；加入样品裂解液；离心取上清；蛋白定量；分装冷冻；样品水化；样品制备完成。本发明专利技术以蚕豆根系为实验材料，填补了蚕豆根系双向电泳技术的空白。本发明专利技术中实验步骤简单，易于操作，重复性好，有实验背景的技术人员易学、易掌握。本发明专利技术中选用的实验试剂均为双向电泳常规试剂，无昂贵、稀有试剂，实验运作成本低。

Sample preparation method for proteomic analysis of Vicia faba root system

The sample preparation method is disclosed faba bean root proteomics analysis: fresh Vicia faba root; liquid nitrogen grinding; phenol extraction liquid; Tris equilibrium phenol saturated solution; centrifugal collection of upper phenol; 0.1mol/L ammonium acetate methanol solution; centrifugal precipitation collection; methanol cleaning is collected; precipitation; precipitation vacuum drying; adding sample lysates were then centrifuged;; protein; packaging frozen samples; hydration; completed sample. The invention takes root silkworm as experimental materials, to fill the gaps in two-dimensional electrophoresis of Vicia faba root. The invention has the advantages of simple experimental procedure, easy operation and good repeatability, and the technical personnel with experimental background are easy to learn and easy to master. The experimental reagents selected in the invention are both two-dimensional electrophoresis conventional reagents, and have no expensive and rare reagents, and the experimental operation cost is low.

【技术实现步骤摘要】
蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法
本申请属于生物化学领域，具体涉及一种蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法。
技术介绍
随着人类基因组计划的全面实施与推进，生命科学已经进入了后基因组时代，其主要研究对象已转变为功能基因组学的研究。蛋白质组学(Proteomics)是以活细胞内基因组编码的全部蛋白质为研究对象，其研究被认为是后基因组时代生命科学研究的核心内容之一且日趋成为研究热点而备受关注。双向电泳(two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)可以对生物细胞或组织全蛋白质表达进行定性或定量的综合分析，尤其是用于揭示不同条件下蛋白质表达的变化。蛋白质样品的制备是双向电泳的第一步，也是最重要的一步，样品制备的好坏直接影响到随后蛋白的分离及最后分析结果的可靠性。作物不同器官的蛋白质组成特征是有差异的，样品制备方法要根据不同实验材料进行选择，针对材料选择特异的提取方法可以得到更好的分离效果。样品制备分为蛋白质的提取、裂解液配方的选择、杂质的去除等步骤，在处理样品的时候，如果这些步骤中的任何一步没有充分完成，分离可能不完全或失败，并且，一些信息也可能丢失。因此样品的制备极为关键，而建立有效的样品制备方法，高分辨地分离蛋白质一直是植物蛋白质组学研究中双向凝胶电泳技术不断改进的方向。有关植物组织蛋白质提取方法的研究有很多，然而，没有一种方法适用于所有植物组织。由于根系组成成分复杂、研磨困难，影响根系中色素类、酚类和醌类等物质的清除，故根系蛋白提取方法不同于其他器官的蛋白提取方法。在已报道的作物根系蛋白提取方法中，三氯醋酸/丙酮法、普通的酚抽提法、Tris-HCl法、TCA/丙酮法均有使用，但不同作物其根系的蛋白质组成特征是有差异的，针对材料选择特异的提取方法可以得到更好的分离效果。三氯醋酸/丙酮法是进行蛋白质组学分析最常用的提取方法，提取过程中损失较少，具有广泛的适用性，在拟南芥中取得了很好的分离效果；普通的酚抽提法在油菜、紫花苜蓿根系的蛋白提取中效果最佳；改良后的TCA/丙酮法在水稻、黄瓜、西瓜等作物的根系蛋白提取中提取效果最好，为适宜的蛋白提取方法。有关豆科植物根系蛋白质提取方法鲜有报道，而适合于蛋白质组学分析的蚕豆根系总蛋白提取方法更是未见报道，已报道的豆科植物根系总蛋白提取方法中发现不同的豆科作物在提取根系总蛋白时采用的方法也不同，紫花苜蓿采用酚抽提法(王继峰，2007)、籽粒苋根系采用Tris-HCl法(晋海军，2015)。蚕豆关于蛋白方面研究起步较晚，主要研究集中在食品加工级别的蛋白提取、分离、功能特性研究等方面，而在蛋白质组学方面只有理论综述，而没有实质性的工作进展。为了加快蚕豆蛋白质组学研究步伐，为蚕豆蛋白质组学研究奠定理论基础和技术指导需要建立适合于蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法，为开展蚕豆双向电泳技术迈出第一步。
技术实现思路
有鉴于此，本申请所要解决的技术问题是现有技术中没有通用、有效、适合于蚕豆的蛋白质组学分析样品的制备方法。提供一种适合蛋白质组学分析的蚕豆根系样品制备方法。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法，包括以下步骤：(1)取新鲜蚕豆根系；(2)将所取样品置于预冷至-20℃的研钵内，用液氮快速冷冻并充分研磨至细粉；(3)研磨好的粉末中加入10倍体积酚抽提液，不定时涡旋混匀等待20min后，加入等体积的Tris平衡酚饱和溶液(pH8.0)，4℃放置30min，期间每5min摇晃混匀一次；离心后收集上层酚液；(4)向步骤(3)所述的上层酚液中加入预冷的0.1mol/L醋酸铵-甲醇溶液，-20℃沉淀过夜后，离心收集沉淀；(5)步骤(4)所述的沉淀中加入预冷甲醇，轻微混合后，4℃离心，弃上清液，沉淀中加入预冷丙酮，轻微混合，4℃离心，收集沉淀；(6)步骤(5)所得的沉淀真空干燥至水分≤8％，得粉末；(7)步骤(6)所得粉末溶解液于样品裂解液，23℃下放置3h以上，期间涡旋混匀2～3次；(8)裂解结束后，离心取上清液，上清液再次离心，取上清液作为待分析溶液；(9)绘制标准曲线，取待分析的上清液与考马斯亮蓝蛋白试剂反应，测定吸光值，根据标准曲线测定待分析溶液中蛋白质的浓度；样品蛋白浓度(μg/μl)＝X/样品体积(μl)；(10)按根系蛋白总上样量200μg，上样总体积350μl，计算蛋白体积，并分装后-80℃保存；样品蛋白体积(μl)＝200μg/样品蛋白浓度(11)从-80℃取出蛋白样品，自然溶解后按上样总体350μl和蛋白体积，计算出水化液体积，加入蛋白样品水化液，离心，即得蚕豆根系蛋白质组学分析样品；水化液体积＝350μl-蛋白体积。进一步的，步骤(3)中所述的酚抽提液为0.7mol/L蔗糖、0.1mol/LNaCl、0.5mol/LTris-HCl(PH7.5)、50mmol/LEDTA-2Na和0.2％DTT的混合溶液；所述的离心条件为5000×g，10min。进一步的，步骤(4)中加入的醋酸铵-甲醇溶液的量为上层酚液体积的5倍；预冷至-20℃。进一步的，步骤(4)中所述的离心条件为12000×g，10min。进一步的，步骤(5)中所述的离心条件都为12000×g，10min。进一步的，步骤(7)中所述的样品裂解液为8mol/L尿素、2％聚乙二醇辛基苯基醚、60mmol/L二硫苏糖醇的混合溶液。进一步的，步骤(9)中所述蛋白浓度标准曲线以牛血清蛋白为标准蛋白，以Bradford方法绘制。进一步的，步骤(9)中所述考马斯亮蓝蛋白试剂包括：质量浓度为0.01％的考马斯亮蓝G-250，质量浓度为4.75％的乙醇和质量浓度为8.5％的磷酸；所述反应时间为5min，检测波长为595nm。进一步的，步骤(11)中所述蛋白样品水化液包括：7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4％CHAPS，65mmol/L二硫苏糖醇，0.2％载体两性电解质和0.001％溴酚蓝。进一步的，步骤(8)和步骤(11)中的离心条件均为4℃、20000×g下离心20min。对三氯醋酸/丙酮法、普通的酚抽提法、Tris-HCl法、TCA/丙酮法4种植物根系蛋白提取方法进行了比较，发现普通的酚抽提法主要针对于干扰物比例较大的植物材料，是最适于蚕豆根系蛋白提取。同时，根据蚕豆根系特点，对普通酚抽提法进行了方法改进，使改进后的酚抽提法更适合于蚕豆根系的蛋白质提取。在沉淀洗涤过程中增加了用5倍体积预冷甲醇清洗沉淀。清洗离心后再用预冷丙酮清洗沉淀。目的是醋酸铵在甲醇、丙酮等有机溶剂中有较好的溶解度，先用甲醇洗净残留在沉淀中的醋酸铵，然后再用丙酮将甲醇去除干净，避免重新引入离子。将普通酚抽提法中在样品粉末中一次性加入蛋白提取液以及等体积的Tris-饱和酚，振荡混匀，调整为分步加入：样品粉末中加入蛋白提取液混合等待20min，期间不定时混匀，然后再加入等体积Tris-饱和酚混合30min以上，期间每5min钟摇晃混匀一次。原因：植物组织中的干扰物质主要有酚类化合物、蛋白水解酶、蛋白氧化酶、萜类、色素、有机酸、盐离子、多糖、脂类、多种次生代谢产物，这些干扰物质可导致2-DE图上横向和纵向的条纹，背景模糊降低蛋白点的分辨率。将样本研磨破碎成粉末后先加入蛋白提取液本文档来自技高网...

【技术保护点】
蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取新鲜蚕豆根系；(2)将所取样品置于预冷至‑20℃的研钵内，用液氮快速冷冻并充分研磨至细粉；(3)研磨好的粉末中加入10倍体积酚抽提液，不定时涡旋混匀等待20min后，加入等体积的Tris平衡酚饱和溶液(pH8.0)，4℃放置30min，期间每5min摇晃混匀一次；离心后收集上层酚液；(4)向步骤(3)所述的上层酚液中加入预冷的0.1mol/L醋酸铵‑甲醇溶液，‑20℃沉淀过夜后，离心收集沉淀；(5)步骤(4)所述的沉淀中加入预冷甲醇，轻微混合后，4℃离心，弃上清液，沉淀中加入预冷丙酮，轻微混合，4℃离心，收集沉淀；(6)步骤(5)所得的沉淀真空干燥至水分≤8％，得粉末；(7)步骤(6)所得粉末溶解液于样品裂解液，23℃下放置3h以上，期间涡旋混匀2～3次；(8)裂解结束后，离心取上清液，上清液再次离心，取上清液作为待分析溶液；(9)绘制标准曲线，取待分析的上清液与考马斯亮蓝蛋白试剂反应，测定吸光值，根据标准曲线测定待分析溶液中蛋白质的浓度；样品蛋白浓度(μg/μl)＝X/样品体积(μl)；(10)按根系蛋白总上样量200μg，上样总体350μl，计算蛋白体积，并分装后‑80℃保存；样品蛋白体积(μl)＝200μg/样品蛋白浓度(11)从‑80℃取出蛋白样品，自然溶解后按上样总体350μl和蛋白体积，计算出水化液体积，加入蛋白样品水化液，离心，即得蚕豆根系蛋白质组学分析样品；水化液体积＝350μl‑蛋白体积。...

【技术特征摘要】
1.蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取新鲜蚕豆根系；(2)将所取样品置于预冷至-20℃的研钵内，用液氮快速冷冻并充分研磨至细粉；(3)研磨好的粉末中加入10倍体积酚抽提液，不定时涡旋混匀等待20min后，加入等体积的Tris平衡酚饱和溶液(pH8.0)，4℃放置30min，期间每5min摇晃混匀一次；离心后收集上层酚液；(4)向步骤(3)所述的上层酚液中加入预冷的0.1mol/L醋酸铵-甲醇溶液，-20℃沉淀过夜后，离心收集沉淀；(5)步骤(4)所述的沉淀中加入预冷甲醇，轻微混合后，4℃离心，弃上清液，沉淀中加入预冷丙酮，轻微混合，4℃离心，收集沉淀；(6)步骤(5)所得的沉淀真空干燥至水分≤8％，得粉末；(7)步骤(6)所得粉末溶解液于样品裂解液，23℃下放置3h以上，期间涡旋混匀2～3次；(8)裂解结束后，离心取上清液，上清液再次离心，取上清液作为待分析溶液；(9)绘制标准曲线，取待分析的上清液与考马斯亮蓝蛋白试剂反应，测定吸光值，根据标准曲线测定待分析溶液中蛋白质的浓度；样品蛋白浓度(μg/μl)＝X/样品体积(μl)；(10)按根系蛋白总上样量200μg，上样总体350μl，计算蛋白体积，并分装后-80℃保存；样品蛋白体积(μl)＝200μg/样品蛋白浓度(11)从-80℃取出蛋白样品，自然溶解后按上样总体350μl和蛋白体积，计算出水化液体积，加入蛋白样品水化液，离心，即得蚕豆根系蛋白质组学分析样品；水化液体积＝350μl-蛋白体积。2.根据权利要求1所述的蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的酚抽提液为0.7mol/L蔗糖、0.1mol/LNaCl、0.5mol/LTris-HCl(PH7.5)、5...

【专利技术属性】
技术研发人员：李萍，刘玉皎，
申请(专利权)人：青海大学，
类型：发明
国别省市：青海,63