一种高含量虾青素血球藻的规模化生产方法技术

本发明专利技术公开一种高含量虾青素血球藻的规模化生产方法，包括藻种的培养、种瓶培养、封闭式管道光生物反应器培养、室内池光生物反应器培养和室外池反应器虾青素累积培养；藻种先在实验室内优化的生长条件下，使其快速生长繁殖，待累积到一定的细胞量后，通过无菌管路接种到封闭式管道光生物反应器中进行二级扩大培养，待红球藻生长到一定密度，再接种到室内池式光生物反应器中进行三级生长培养，达到最高藻细胞数，随后将培养完成后的红球藻绿色细胞转入室外池式生物反应器中，在胁迫条件下使其大量累积虾青素，最终完成雨生红球藻的规模化生产流程。与现有技术相比本发明专利技术虾青素含量超过目前报道的国际水平，达7.2%以上。

Method for large-scale production of astaxanthin with high content of astaxanthin

The scale of the production method of the invention discloses a high content of astaxanthin in Haematococcus algae, including culture, culture, the bottle sealed tube photobioreactor, Muronai Ikemitsu bioreactor culture and outdoor pool reactor of astaxanthin accumulation in algae culture; to optimize in laboratory growth conditions, make it fast the growth and reproduction of cells to be accumulated to a certain amount, the aseptic inoculation to the closed two level pipeline pipe expanding culture photobioreactor, to pluvialis growth to a certain density, and then inoculated into the indoor pool when the bioreactor was three growth, reaching the highest number of algal cells, then after the completion of the cultivation of Haematococcus green cells into outdoor pool reactor, under stress conditions the accumulation of astaxanthin, the final completion of Yu Shenghong / scale Production process. Compared with the prior art, the astaxanthin content of the invention is more than 7.2% of the international level reported at present.

【技术实现步骤摘要】
一种高含量虾青素血球藻的规模化生产方法
本专利技术涉及生物培养
，具体涉及一种高含量虾青素血球藻培养方法。
技术介绍
虾青素具有超强的抗氧化和捕获自由基的能力，能有效淬灭在剧烈活动过程中肌肉内产生的大量单线态氧和自由基等废物。自由基的化学性质非常活泼，极易参加氧化还原反应，能触发链式反应而导致生物膜上的脂质发生过氧化，从而破坏膜的结构和功能；它能引起蛋白质变性和交联，使酶和激素失活；使机体的免疫能力降低，破坏核酸的结构并导致代谢异常等。虾青素分子有很长的共轭双键，有羟基和位于共轭双键链末端的不饱和酮基，其中羟基和酮基又构成a-羟基酮（见图1），这些结构都具有活泼的电子效应，能向自由基提供电子或吸引自由基的未配对电子，易与自由基反应而清除自由基，起到抗氧化作用。许多类胡萝卜素都具有生物抗氧化剂的功能，但虾青素的抗氧化作用比一般的类胡萝卜素更强，其还原活性是其它类胡萝卜素的10倍，为维生素E的100~550倍，被称为超级维生素E。虾青素具有增强免疫力，抗癌症，防止皮肤衰老，维护眼睛及中枢神经系统健康等多种生理功能。虾青素进入生物体后可以不经修饰或生物转化直接贮存在组织中，使一些水生动物的皮肤和肌肉出现健康而鲜艳的颜色，使禽的羽毛、皮肤、脚及禽蛋呈现金黄色或红色。此外，在增加养殖对象着色，提高存活率，促进生长、繁殖、发育等方面也具有显著作用。欧美及日本等国已批准将其作为安全的动物饲料。近年，虾青素已广泛应用于水产养殖中。此外，在保健品、化妆品及医药方面，虾青素强大的生理功效和广阔的市场前景也引起了国际上的普遍关注。目前，国外已成功实现了虾青素的商业化生产，其市场售价约为每千克2500美元，且需求量正在迅速上升中。美国Cyanotech公司已从雨生红球藻中提取虾青素，生产出了BioAstin天然虾青素胶囊，并通过了美国食品及药品管理局认证，达到GMP标准。该产品在美国、俄罗斯、澳大利亚、日本等地区已成为人们首选的纯天然补充食品。国际上已具备的虾青素生产工艺有化学合成和生物提取两种，但化学合成的虾青素在结构、功能、应用及安全性等方面均较天然虾青素逊色。目前，世界各国对化学合成虾青素的管理越来越严，如美国已禁止其进入保健食品市场。动物和人体实验的结果表明，天然虾青素无任何致病效应或毒副作用，对人体绝对安全。因此，开发天然虾青素及其生物来源已成为虾青素生产研究的一项重要课题。如今，在天然虾青素的生物来源中，雨生红球藻中的虾青素含量最高，该藻在逆境中可积累虾青素，其细胞内积累的虾青素占类胡萝卜素总量的90%以上，虾青素含量可达藻体干重的8%。所含虾青素的结构形式亦与水生动物所需一致，所以被公认为自然界中生产虾青素最好的生物来源，并已成为近年来国内外虾青素研究的热点。雨生红球藻Haematococcuspluvialis是一种生活在淡水中的单细胞绿藻，隶属于绿藻门(Chlorophyta)、绿藻纲（Chlorophyceae)、团藻目(Volvocales)、红球藻科(Haematococceae)、红球藻属(Haematococcus)，是目前已知的虾青素含量最高的生物。雨生红球藻因自身所积累虾青素物质可高达干重的1.5%～3.0%，被视为天然虾青素的“浓缩品”。因此规模化培养雨生红球藻成为获取天然虾青素的最佳途径，是目前得到各国大力推进的新型生物技术产业。在自然界中，雨生红球藻常分布于小面积间歇性水体。雨生红球藻生长过程可分为两个阶段，游动阶段和不动阶段。游动阶段的红球藻细胞呈卵形或椭圆形，细胞宽3~5μm，长3~8μm，有时甚至更大些。原生质体和细胞壁间由很多分枝或不分枝的细胞质连丝相连，空隙充满胶状物质；原生质体前端常呈乳头状突起；伸缩泡数个至数十个，不规则地分散于原生质体内；运动细胞具两条顶生、等长、约等于体长的鞭毛，通过前端的叉状胶质管伸出细胞壁；细胞核位于细胞中央；叶绿体呈杯状、复杂的网状或颗粒状，并且具有典型的绿藻蛋白核；具一个眼点，位于细胞近中部的一侧。游动阶段细胞呈绿色，不动阶段细胞呈圆形，无鞭毛，不会游动，大多沉在水底。细胞大小变化幅度较大，细胞大小宽19~51μm，长28~63μm。细胞壁由纤维素层和果胶层组成，且含有花粉素样成分。环境胁迫下，形态发生巨大变化：鞭毛逐渐消失，成为不能运动的休眠细胞；原生质中积累了大量含虾青素的脂质小体；细胞壁增厚，以抵抗氧化性损伤；细胞体积增大，直径可达原来10倍；分裂停止；细胞逐渐变红。此时的细胞称为静孢子或厚壁孢子(陈峰等，1999；Fabregasetal.，2001：朱劲华等.2003)，该阶段细胞壁与膜的距离较近，有的壁薄，有的则较厚。不动阶段的细胞常因虾青素积累使整个细胞呈红色。雨生红球藻生长的营养类型有二种：(1)光合自养型，即利用光能吸收二氧化碳进行光合自养生长；(2)异养生长型，利用有机碳源如醋酸盐在黑暗条件下进行异养生长：(3)混合营养型，即在光照条件下同时利用有机碳源和二氧化碳进行混合营养生长。生长的营养类型不同，雨生红球藻的适宜生长条件也有差异。通常，处于旺盛生长阶段的雨生红球藻细胞为绿色。在弱光、氮磷丰富的环境中，雨生红球藻生长旺盛，细胞内含有少量虾青素，主要以绿色的游动细胞形式存在；而在不利于生存的条件(高光照、高温、高盐和营养盐饥饿)下，细胞分裂减慢，细胞变成不动状态(厚壁孢子)并积累虾青素。此时，藻细胞中常因含有大量虾青素而呈现红色。国内外已进行了大量雨生红球藻中虾青素积累机制的研究工作，所获结论多有争议。主要有两种观点，一种观点认为，强光下虾青素的积累主要起到滤光作用，保护旺盛生长的雨生红球藻细胞及其光合作用免受强光的伤害；另一种观点认为，虾青素的积累是不动细胞的次生代谢产物，仅限于逆境条件下发生。Tjahjono等(1994)研究表明，光诱导产生活性氧，促进虾青素合成，抵抗逆境引起的氧化损伤。作为一种次生的类胡萝卜素，虾青素及其在细胞内的积累部位一直是研究的焦点。庄惠如等(2000)应用透射电镜研究了在胁迫条件下，雨生红球藻积累虾青素过程中藻细胞的超微结构变化。发现随着细胞丧失运动能力，转变成厚壁孢子，在核周围开始迅速沉积色素，色素颗粒几乎占据细胞质的大部分区域并相互融合，但其沉积位置则保持不变。证实环境胁迫可导致雨生红球藻细胞大量沉积次生类胡萝卜素，积累部位在质体外，细胞核周围的细胞质基质中。随着色素颗粒的增多，酯溶性色素小颗粒彼此融合，形成更大的颗粒，进而掩盖了叶绿素使得细胞呈现出明亮的红色。然而，虾青素的雨生红球藻生产技术仍有待完善，尤其在雨生红球藻培养、虾青素积累及提取等方面仍存在相当的技术难题。目前在培养雨生红球藻生产虾青素过程通常采用一步法，即在同一培养装置中完成全部的生产工艺。光生物反应器技术应用于雨生红球藻生产虾青素通常采取一步法的生产模式（ZL02138827.X），即在同一生物反应器中需要完成雨生红球藻营养细胞的培养扩增，转化及虾青素累积，导致了一次性成本投入极高，调控复杂，产品效益不明显。如公告号为CN1966660，专利名称为“大规模培养雨生红球藻和转化虾青素的装置及其方法”的专利技术专利，公开了一种设置在固定架上的光生物反应器系统的培养装置。国内外较多采用两步法诱导雨生红球藻细胞积累虾本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高含量虾青素血球藻的规模化生产方法，其特征在于：包括藻种的培养、种瓶培养、封闭式管道光生物反应器培养、室内池光生物反应器培养和室外池反应器虾青素累积培养；藻种先在实验室内优化的生长条件下，使其快速生长繁殖，待累积到一定的细胞量后，通过无菌管路接种到封闭式管道光生物反应器中进行二级扩大培养，待红球藻生长到一定密度，再接种到室内池式光生物反应器中进行三级生长培养，达到最高藻细胞数，随后将培养完成后的红球藻绿色细胞转入室外池式生物反应器中，在胁迫条件下使其大量累积虾青素，最终完成雨生红球藻的规模化生产流程。

【技术特征摘要】
1.一种高含量虾青素血球藻的规模化生产方法，其特征在于：包括藻种的培养、种瓶培养、封闭式管道光生物反应器培养、室内池光生物反应器培养和室外池反应器虾青素累积培养；藻种先在实验室内优化的生长条件下，使其快速生长繁殖，待累积到一定的细胞量后，通过无菌管路接种到封闭式管道光生物反应器中进行二级扩大培养，待红球藻生长到一定密度，再接种到室内池式光生物反应器中进行三级生长培养，达到最高藻细胞数，随后将培养完成后的红球藻绿色细胞转入室外池式生物反应器中，在胁迫条件下使其大量累积虾青素，最终完成雨生红球藻的规模化生产流程。2.根据权利要求1所述的一种高含量虾青素血球藻培养方法，其特征在于：所述的种瓶培养阶段是采取诱变育种的方法筛选出室内外生长均适合，且生长周期短，生产率高，虾青素含量高的藻株，包括如下步骤：1）EMS诱变：将Haematococcuspluvialis系列雨生红球藻天然藻种培养到对数生长期的藻液600ml，4000rpm离心5min，弃上清液；将不同剂量EMS加入到0.06M、pH值为7.0的磷酸缓冲液中配置得到最终浓度分别为0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%的诱变液，分别将藻体加入六种诱变液中在黑暗条件下处理4h，然后加入1ml、5%的硫代硫酸钠终止诱变反应，离心去除诱变液，藻体用新鲜营养液洗涤两次，避光12h后置于光照条件下培养；2）叠氮钠诱变：将Haematococcuspluvialis系列雨生红球藻天然藻种培养到对数生长期的藻液900ml均分到9个250ml的三角瓶中，取不同量的叠氮钠溶液加入各个三角瓶中，迅速混匀，使叠氮钠的最终的浓度分别为100mg/L、120mg/L、140mg/L、160mg/L、180mg/L、200mg/L、220mg/L、240mg/L、260mg/L，黑暗中处理12小时，4000rpm离心5min，去除诱变液并用新鲜的营养液洗涤...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱展，董浩，曹喜梅，杨兰苹，高嵩，
申请(专利权)人：烟台布鲁拜尔生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37