一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法技术

本发明专利技术公开了一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法，涉及病原的分离和培养领域。包括病斑采集、消毒处理、分离培养、病原纯化、培养病原藻五个步骤，另外本发明专利技术还提供了培养山茶藻斑病病原的Chu10营养液和Chu10营养基。本发明专利技术的有益效果在于：本发明专利技术山茶藻斑病病原的分离和培养方法，它能快速有效的将山茶藻斑病病原分离和培养，防止受到细菌和真菌的污染，整个过程污染少，周期短，纯化效果好。

【技术实现步骤摘要】
一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法
本专利技术主要涉及病原的分离和培养领域，具体是一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法。
技术介绍
山茶(Camelliajaponica)是重要绿化苗木之一。随着山茶花生产基地的不断扩大，园林绿化的普遍应用，国内外品种的频繁交换，苗木大范围的运输流通，再加上全球气候变暖等因素，山茶花的病害发生呈上升趋势，尤以山茶藻斑病的发生最为明显。山茶藻斑病发生于植株叶片及嫩枝上，以叶片为主。发病初期，感病叶片上产生细小圆点，灰绿色或灰白色，上覆疏松污白色丝状物，放射状向四周扩展，以后逐渐扩展，形成圆形或不规则形病斑，病斑中部灰褐色或深褐色，边缘仍为绿色，病斑稍隆起，表面呈毛毡状，直径0.5-1.2cm，病斑背面凹陷。山茶藻斑病的发生轻则影响植株正常生长，导致植株生长不良、品质下降，从而丧失观赏价值及绿化效果；重则引起整株死亡，造成重大经济损失，给山茶花产业带来较大影响。在生产实践中，人们主要使用化学农药来控制山茶藻斑病的发生，但药剂防治的关键期和施药次数的确定主要是凭经验，缺乏科学依据，以致防治效果不理想，而只有掌握了病原的生理特性和侵染循环，才能科学的制定防治时期和防治对策。但是山茶藻斑病的病原分离困难，一般分离时易受细菌和真菌的污染，因此，急需建立山茶藻斑病病原的分离和培养方法，继而研究病原的生理特性及与病害发生的内在关系，为该病害的有效防控提供理论依据。
技术实现思路
为解决现有技术的不足，本专利技术提供了一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法，它能快速有效的将山茶藻斑病病原分离和培养，防止受到细菌和真菌的污染。本专利技术为实现上述目的，通过以下技术方案实现：一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法，包括病斑采集、消毒处理、分离培养、病原纯化、培养病原藻，具体步骤如下：步骤一：病斑采集：采集新鲜的病叶标本装入洁净的保鲜袋，带回实验室用自来水冲洗20-30min，备用；步骤二：消毒处理：选择步骤一中病斑较多的叶片，在超净工作台无菌环境下，用无菌剪刀剪下直径4-6mm的病组织圆片，用体积比75％的酒精处理20-30s，然后用无菌水冲洗4-6次，备用；步骤三：分离培养：将步骤二中经无菌水冲洗的病组织用无菌滤纸吸取表面水分，然后用镊子将病组织分别放入到Chu10营养基或营养液中，编号、密封后放入到温度22-28℃的光照培养箱内，按照光照12h，黑暗12h进行培养7-10d，观察其变化；步骤四：病原纯化：待步骤三中培养的病组织周围有疑似藻类产生，分别将藻类似物在装有Chu10营养基的培养皿上斜45度角涂抹4-5次，做好标记，放入到温度22-28℃的光照培养箱内，按照光照12h，黑暗12h进行培养，得到藻类病原；步骤五：培养病原藻：将步骤四中分离得到的藻类病原，转接到Chu10营养液中，然后在温度22-28℃、光照12h、黑暗12h的条件下以50-100r/min的转速摇床振荡培养7-10d，最终得到纯化的山茶藻斑病病原。上述山茶藻斑病病原的分离和培养方法，所述Chu10营养液由如下组份的原料制成：3.67g/100mLCaCl2·2H2O溶液1份，3.69g/100mLMgSO4·7H2O溶液1份，1.26g/100mLNaHCO3溶液1份，0.87g/100mLK2HPO4溶液1份，8.50g/100mLNaNO3溶液1份，2.84g/100mLNa2SiO3·9H2O溶液1份，3.35g/100mL的柠檬酸和3.35g/100mL的柠檬酸铁混合得到的柠檬酸铁溶液1份，微量营养素溶液1份，蒸馏水1000份。上述山茶藻斑病病原的分离和培养方法，所述微量营养素溶液是由1000mL的蒸馏水中加入Na2EDTA50.0mg、H3BO3618.0mg、CuSO4·5H2O19.6mg、ZnSO4·7H2O44.0mg、CoCl2·6H2O20.0mg、MnCl2·4H2O12.6mg、Na2MoO4·2H2O12.6mg制备而成。上述山茶藻斑病病原的分离和培养方法，所述Chu10营养基是由1000mL的Chu10营养液中加入15-20g的琼脂粉，加热溶解而成。上述山茶藻斑病病原的分离和培养方法，步骤三中所述Chu10营养基装入到培养皿中，每个培养皿放5-8个病组织圆片，并在皿底记上编号，密封后对其进行培养。上述山茶藻斑病病原的分离和培养方法，步骤四中所述藻类似物用蘸取无菌水的无菌棉签在病斑边缘刮取，然后涂布到Chu10固体培养基上。上述山茶藻斑病病原的分离和培养方法，步骤三中所述Chu10营养液装入到三角瓶中，每个三角瓶放6-10个病组织圆片，在瓶身标号，密封后对其进行培养。上述山茶藻斑病病原的分离和培养方法，步骤四中所述藻类似物用三角形玻璃涂布棒涂布到Chu10固体培养基上。上述山茶藻斑病病原的分离和培养方法，步骤五中所述藻类病原转接到装有Chu10营养液的耐高温带无菌透气膜瓶盖的PC组培瓶中，进行摇床振荡培养。上述山茶藻斑病病原的分离和培养方法，步骤五中所述藻类病原转接到装有Chu10营养液的试管中，用无菌透气封口膜封住管口，膜用细线绑定，进行摇床振荡培养。对比现有技术，本专利技术的有益效果是：本专利技术山茶藻斑病病原的分离和培养方法，它能快速有效的将山茶藻斑病病原分离和培养，防止受到细菌和真菌的污染，整个过程污染少，周期短，纯化效果好，具体体现在：1)本专利技术采用的新鲜病组织病原活性强，病组织用自来水冲洗后能最大程度减少病部组织表面的其它微生物，免除病组织中其它微生物的干扰；2)本专利技术采用75％的酒精对病组织圆片进行处理，消毒迅速，不但可免除病组织其它杂菌的干扰，又能保持病组织病原的活性；3)本专利技术采用将无菌水冲洗的病组织用无菌滤纸吸取表面水分，有效降低了分离过程中的污染问题，使得污染率能降低30％以上；4)本专利技术采用的Chu10营养液比常用的藻类培养液Basel和BG11更利于山茶藻斑病病原的生长和繁殖，病藻在Chu10营养液中一般培养7-10d后藻类进入对数生长期，而在Basel和BG11营养液中一般需培养15d藻类才进入对数生长期；5)本专利技术PC组培瓶培养病原藻大多适用于大量藻液培养，试管培养病原藻大多在室内病藻的生物学特性等测定时采用；6)本专利技术采用摇床低转速对山茶藻斑病病原振荡培养，解决了病原培养过程中通气问题，同时能使藻细胞和营养液充分接触，生长迅速。附图说明附图1是本专利技术山茶藻斑病症状；附图2是本专利技术实施例1中病组织的分离；附图3是本专利技术实施例2中病组织的分离；附图4是本专利技术病原藻的PC组培瓶培养；附图5是本专利技术病原藻的试管培养。具体实施方式结合附图和具体实施例，对本专利技术作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所限定的范围。需要说明的是，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1：一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法，包括病斑采集、消毒处理、分离培养、病原纯化、培养病原藻，具体步骤如下：步骤一：病斑采集：采集新鲜的病叶标本装入洁净的保鲜袋，带回实验室用自来水冲洗20m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法，其特征在于：包括病斑采集、消毒处理、分离培养、病原纯化、培养病原藻，具体步骤如下：步骤一：病斑采集：采集新鲜的病叶标本装入洁净的保鲜袋，带回实验室用自来水冲洗20‑30min，备用；步骤二：消毒处理：选择步骤一中病斑较多的叶片，在超净工作台无菌环境下，用无菌剪刀剪下直径4‑6mm的病组织圆片，用体积比75％的酒精处理20‑30s，然后用无菌水冲洗4‑6次，备用；步骤三：分离培养：将步骤二中经无菌水冲洗的病组织用无菌滤纸吸取表面水分，然后用镊子将病组织分别放入到Chu10营养基或营养液中，编号、密封后放入到温度22‑28℃的光照培养箱内，按照光照12h，黑暗12h进行培养7‑10d，观察其变化；步骤四：病原纯化：待步骤三中培养的病组织周围有疑似藻类产生，分别将藻类似物在装有Chu10营养基的培养皿上斜45度角涂抹4‑5次，做好标记，放入到温度22‑28℃的光照培养箱内，按照光照12h，黑暗12h进行培养，得到藻类病原；步骤五：培养病原藻：将步骤四中分离得到的藻类病原，转接到Chu10营养液中，然后在温度22‑28℃、光照12h、黑暗12h的条件下以50‑100r/min的转速摇床振荡培养7‑10d，最终得到纯化的山茶藻斑病病原。...

【技术特征摘要】
1.一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法，其特征在于：包括病斑采集、消毒处理、分离培养、病原纯化、培养病原藻，具体步骤如下：步骤一：病斑采集：采集新鲜的病叶标本装入洁净的保鲜袋，带回实验室用自来水冲洗20-30min，备用；步骤二：消毒处理：选择步骤一中病斑较多的叶片，在超净工作台无菌环境下，用无菌剪刀剪下直径4-6mm的病组织圆片，用体积比75％的酒精处理20-30s，然后用无菌水冲洗4-6次，备用；步骤三：分离培养：将步骤二中经无菌水冲洗的病组织用无菌滤纸吸取表面水分，然后用镊子将病组织分别放入到Chu10营养基或营养液中，编号、密封后放入到温度22-28℃的光照培养箱内，按照光照12h，黑暗12h进行培养7-10d，观察其变化；步骤四：病原纯化：待步骤三中培养的病组织周围有疑似藻类产生，分别将藻类似物在装有Chu10营养基的培养皿上斜45度角涂抹4-5次，做好标记，放入到温度22-28℃的光照培养箱内，按照光照12h，黑暗12h进行培养，得到藻类病原；步骤五：培养病原藻：将步骤四中分离得到的藻类病原，转接到Chu10营养液中，然后在温度22-28℃、光照12h、黑暗12h的条件下以50-100r/min的转速摇床振荡培养7-10d，最终得到纯化的山茶藻斑病病原。2.根据权利要求1所述的一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法，其特征在于：所述Chu10营养液由如下组份的原料制成：3.67g/100mLCaCl2·2H2O溶液1份，3.69g/100mLMgSO4·7H2O溶液1份，1.26g/100mLNaHCO3溶液1份，0.87g/100mLK2HPO4溶液1份，8.50g/100mLNaNO3溶液1份，2.84g/100mLNa2SiO3·9H2O溶液1份，3.35g/100mL的柠檬酸和3.35g/100mL的柠檬酸铁混合得到的柠檬酸铁溶液1份，微量营养素溶液1份，...

【专利技术属性】
技术研发人员：何美仙，申婷，李君荣，
申请(专利权)人：金华职业技术学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33